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上海士鋒生物科技有限公司
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士鋒生物親和層析(Affinity Chromatography)

時(shí)間:2014/5/23閱讀:766
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親和層析(Affinity Chromatography)是利用生物分子間專一的親和力而進(jìn)行分離的一種層析技術(shù)。人們很早就認(rèn)識(shí)到蛋白質(zhì)、酶等生物大分子物質(zhì)能和某些相對(duì)應(yīng)的分子專一而可逆的結(jié)合,可以用于對(duì)生物分子的分離純化。但由于技術(shù)上的限制,主要是沒有合適的固定配體的方法,所以在實(shí)驗(yàn)中沒有廣泛的應(yīng)用。直到60年代末,溴化氰活化多糖凝膠并偶聯(lián)蛋白質(zhì)技術(shù)的出現(xiàn),解決了配體固定化的問題,使得親和層析技術(shù)得到了快速的發(fā)展。親和層析是分離純化蛋白質(zhì)、酶等生物大分子zui為特異而有效的層析技術(shù),分離過程簡(jiǎn)單、快速,具有很高的分辨率,在生物分離中有廣泛的應(yīng)用。同時(shí)它也可以用于某些生物大分子結(jié)構(gòu)和功能的研究。
親和層析的基本原理
生物分子間存在很多特異性的相互作用,如我們熟悉的抗原-抗體、酶-底物或抑制劑、激素-受體等等,它們之間都能夠?qū)R欢赡娴慕Y(jié)合,這種結(jié)合力就稱為親和力。親和層析的分離原理簡(jiǎn)單的說就是通過將具有親和力的兩個(gè)分子中一個(gè)固定在不溶性基質(zhì)上,利用分子間親和力的特異性和可逆性,對(duì)另一個(gè)分子進(jìn)行分離純化。被固定在基質(zhì)上的分子稱為配體,配體和基質(zhì)是共價(jià)結(jié)合的,構(gòu)成親和層析的固定相,稱為親和吸附劑。親和層析時(shí)首先選擇與待分離的生物大分子有親和力物質(zhì)作為配體,例如分離酶可以選擇其底物類似物或競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑為配體,分離抗體可以選擇抗原作為配體等等。并將配體共價(jià)結(jié)合在適當(dāng)?shù)牟蝗苄曰|(zhì)上,如常用的Sepharose-4B 等。將制備的親和吸附劑裝柱平衡,當(dāng)樣品溶液通過親和層析柱的時(shí)候,待分離的生物分子就與配體發(fā)生特異性的結(jié)合,從而留在固定相上;而其它雜質(zhì)不能與配體結(jié)合,仍在流動(dòng)相中,并隨洗脫液流出,這樣層析柱中就只有待分離的生物分子。通過適當(dāng)?shù)南疵撘簩⑵鋸呐潴w上洗脫下來,就得到了純化的待分離物質(zhì)。
前面介紹的一些層析方法,如吸附層析、凝膠過濾層析、離子交換層析等都是利用各種分子間的理化特性的差異,如分子的吸附性質(zhì)、分子大小、分子的帶電性質(zhì)等等進(jìn)行分離。由于很多生物大分子之間的這種差異較小,所以這些方法的分辨率往往不高。要分離純化一種物質(zhì)通常需要多種方法結(jié)合使用,這不僅使分離需要較多的操作步驟、較長(zhǎng)的時(shí)間,而且使待分離物的回收率降低,也會(huì)影響待分離物質(zhì)的活性。親和層析是利用生物分子所具有的特異的生物學(xué)性質(zhì)-親和力來進(jìn)行分離純化的。由于親和力具有高度的專一性,使得親和層析的分辨率很高,是分離生物大分子的一種理想的層析方法。
親和吸附劑
選擇并制備合適的親和吸附劑是親和層析的關(guān)鍵步驟之一。它包括基質(zhì)和配體的選擇、基質(zhì)的活化、配體與基質(zhì)的偶聯(lián)等等。
基質(zhì)
⑴基質(zhì)的性質(zhì)
基質(zhì)構(gòu)成固定相的骨架,親和層析的基質(zhì)應(yīng)該具有以下一些性質(zhì):
①具有較好的物理化學(xué)穩(wěn)定性。在與配體偶聯(lián)、層析過程中配體與待分離物結(jié)合、以及洗脫時(shí)的pH、離子強(qiáng)度等條件下,基質(zhì)的性質(zhì)都沒有明顯的改變。
②能夠和配體穩(wěn)定的結(jié)合。親和層析的基質(zhì)應(yīng)具有較多的化學(xué)活性基團(tuán),通過一定的化學(xué)處理能夠與配體穩(wěn)定的共價(jià)結(jié)合,并且結(jié)合后不改變基質(zhì)和配體的基本性質(zhì)。
③基質(zhì)的結(jié)構(gòu)應(yīng)是均勻的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),以使被分離的生物分子能夠均勻、穩(wěn)定的通透,并充分與配體結(jié)合?;|(zhì)的孔徑過小會(huì)增加基質(zhì)的排阻效應(yīng),使被分離物與配體結(jié)合的機(jī)率下降,降低親和層析的吸附容量。所以一般來說,多選擇較大孔徑的基質(zhì),以使待分離物有充分的空間與配體結(jié)合。
④基質(zhì)本身與樣品中的各個(gè)組分均沒有明顯的非特異性吸附,不影響配體與待分離物的結(jié)合?;|(zhì)應(yīng)具有較好的親水性,以使生物分子易于靠近并與配體作用。
一般纖維素以及交聯(lián)葡聚糖、瓊脂糖、聚丙烯酰胺、多孔玻璃珠等用于凝膠排阻層析的凝膠都可以作為親和層析的基質(zhì),其中以瓊脂糖凝膠應(yīng)用。纖維素價(jià)格低,可利用的活性基團(tuán)較多,但它對(duì)蛋白質(zhì)等生物分子可能有明顯的非特異性吸附作用,另外它的穩(wěn)定性和均一性也較差。交聯(lián)葡聚糖和聚丙烯酰胺的物理化學(xué)穩(wěn)定性較好,但它們的孔徑相對(duì)比較小,而且孔徑的穩(wěn)定性不好,可能
會(huì)在與配體偶聯(lián)時(shí)有較大的降低,不利待分離物與配體充分結(jié)合,只有大孔徑型號(hào)凝膠可以用于親和層析。多孔玻璃珠的特點(diǎn)是機(jī)械強(qiáng)度好,化學(xué)穩(wěn)定性好。但它可利用的活性基團(tuán)較少,對(duì)蛋白質(zhì)等生物分子也有較強(qiáng)的吸附作用。瓊脂糖凝膠則基本可以較好的滿足上述四個(gè)條件,它具有非特異性吸附低、穩(wěn)定性好、孔徑均勻適當(dāng)、宜于活化等優(yōu)點(diǎn),因此得到了廣泛的應(yīng)用,如Pharmacia 公司的Sepharose-4B、6B 是目前應(yīng)用較多的基質(zhì)。

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