mRNA的分離

與rRNA和tRNA不同的是，哺乳動(dòng)物細(xì)胞的絕大部分mRNA在其3"端均有一poly(A)尾，因此可以用oligo(dT)－纖維素親和層析法從大量的細(xì)胞RNA中分離mRNAdmonds等，1971;At Leder，1972）。在構(gòu)建cdna文庫時(shí)， 必須經(jīng)上述純化步驟制備mRNA模板。

進(jìn)行Northern雜交或Sl 核酸酶作用圖分析時(shí)，與總RNA相比，采用poly(A)+ RNA能獲得更為滿意的結(jié)果。 可以按照Gilham(1964)所述方法制備oligo(dT)－纖維素，也可以買現(xiàn)成的產(chǎn)品。

1）用0.1mol/L NaOH懸浮0.5-1.0g 0ligo(dT)－纖維素。

2）將懸浮液裝入滅菌的一次性層析柱或裝入填有經(jīng)用DEPC處理并經(jīng)高壓滅菌的*的巴期德吸管中， 柱床體積為0.5-1.0ml，用3倍柱床體積滅菌水沖洗柱床。柱床體積為1m的oligo(dT)－纖維素zui大量為10mg總RNA，如果總RNA的量較少，則應(yīng)減少oligo(dT)－纖維素的使用量以防止poly(A)+RNA在過柱以及后續(xù)步驟中損失。

3）用無菌的1x層析柱加樣緩沖液沖洗柱床直至流出液的pH值小于8.0。1x層析柱加樣緩沖液
20mmol/L Tris.Cl(pH7.6)
0.5mol/L NaCl
1mmol/L EDTA(pH8.0)
0.1％SDS
可按以下方法制備滅菌的層析柱加樣緩沖液；將適量無RNA酶的Tris. Cl(pH7.6)、氯化鈉和EDTA貯存液混合在15lbf/in2(1.034x105Pa)高壓下蒸氣滅菌，待其次序卻至65℃左右時(shí)加入已在65℃預(yù)熱30分鐘的10 ％SDS貯存液。也可以用0.05mol/L檸檬酸鈉代替Tris.Cl 然后用DEPC處理檸檬鈉－NaCL-EDTA和SDS的混合溶液。

4）用滅菌水溶解RNA，于65℃溫育5分鐘后使迅速冷卻至室溫，加等體積的2x層析柱加樣緩沖液，上樣，立即用滅菌的試管收集洗液。 當(dāng)所的RNA溶液均進(jìn)入柱床后，加1倍體積的1x層析柱加樣 ，繼續(xù)收集洗出液。加熱RNA可以破壞可能涉及poly(A)尾的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

5）當(dāng)全部溶液流出后，將收集液置于65℃溫育5分鐘，重新上樣，并收集流出液。

6）用5-10倍柱床體積的1x層析柱加樣緩沖液洗柱，分部收集洗出液，測(cè)定每一收集管的OD260。zui補(bǔ)由于不帶poly)A)的RNA洗過柱床， OD260會(huì)很高，后來OD260值則很小或?yàn)榱?。在某些方案中，上述步驟后還用5倍柱術(shù)體積的含0.1mol/L NaCl的1x 層析柱加樣緩沖液洗柱床，然而由于洗出的不帶poly(A)的RNA很少甚至沒有， 因此這一步驟可以省略。

7）用2－3倍柱床體積的經(jīng)滅菌且無RNA酶的洗脫緩沖液洗脫mRNA，以1/3－1/2柱床體積分部收集洗脫液。洗脫緩沖液
10mmol/L Tris.Cl(pH7.6)
1mmol/L EDTA(pH8.0)
0.05％SDS
用于配制洗脫緩沖液的Tris. Cl 和EDTA貯存液應(yīng)為新近高壓的溶液 可用適量的滅菌水稀釋上述貯存液配制洗脫緩沖液。洗脫緩沖液不能高壓處理，因高壓會(huì)使溶產(chǎn)生大量氣泡。

8）收集液置于透明的小溶器內(nèi)，測(cè)定OD260， 使用前比色杯須用濃鹽酸：甲醇（1：1）浸泡1小時(shí)，再用經(jīng)DEPC處理并高壓處理過的水*沖洗合并含有RNA的洗脫組分。經(jīng)上述一輪oligo(dT)－纖維素親和量層析后得到的RNA中，帶與不帶poly(A)的RNA，其含量近乎相等。如欲進(jìn)一步純化mRNA，可將洗脫液于65 ℃溫育3分鐘，迅速冷卻至室溫，加入NaCl至終濃度為0.5mol/L，用同一oligo(dT)纖維素柱進(jìn)行第二輪層析。

9）收集oligo(dT)－纖維素柱層析的洗脫液，在mRNA溶液中加入3mol/L乙酸鈉（pH5.2）至終深度為0.3mol/L并混勻。加2.5 倍體積用冰預(yù)冷的乙醇，混勻，冰浴至少30分鐘。

10）于4℃以10 000g離心15分鐘回收poly(A)+RNA，小心棄去上清液，用70 ％乙醇洗滌沉淀（通?？床灰姵恋恚?，離心片刻，在空氣中晾干核酸沉淀。

11）用少量水重溶RNA，置于比色杯內(nèi)，測(cè)定OD260， 使用前比色杯須用濃鹽酸：甲醇（1：1）浸泡1小時(shí)，再用經(jīng)DEPC處理并高壓處理過的水*沖洗。

12）將mRNA溶液由比色杯移至聚丙烯離心管內(nèi)，加3倍體積乙醇， 混勻，于－70℃保存?zhèn)溆谩；厥誖NA時(shí)，只需取出一小份貯存液，加3mol/K乙酸鈉（pH5.2）至終濃度為0.3mol/L， 混勻，用微量離心機(jī)于4℃以12 000g離心5分鐘即可。
i.OD260＝1的溶液其RNA含量約為40μg/ml.
ii.從107個(gè)哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞中可獲得1－5μg mRNA，所得mRNA通常只占上柱的總RNA的1－2％。