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上海士鋒生物科技有限公司
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DNA的純化濃縮與定量

時(shí)間:2015/11/3閱讀:682
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實(shí)驗(yàn)?zāi)康?BR>將復(fù)雜的細(xì)胞分子混合物加入有機(jī)溶媒萃取以除去蛋白質(zhì)及其它成分,就可以純化DNA。一般常用酚及氯仿(phenol/chloroform)可使蛋白質(zhì)變性(denaturaion)的特性來進(jìn)行萃取的步驟,DNA和RNA不溶于有機(jī)溶媒中,而溶于水層。另外,分子選殖(molecular cloning)常利用洋菜膠(agarose)來分離不同大小的DNA片段或用以純化DNA。
核酸定量可利用核酸會(huì)吸收260及280 nm波長(zhǎng)的UV光,而且可與熒光染劑ethidium bromide (EtBr)鍵結(jié),這些物理特性即一般定量DNA的的基本原理。此外亦可藉由UV光的吸收來評(píng)估DNA的純度,若純化DNA的量足夠時(shí),可用光譜分析法定量,當(dāng)DNA量少或不純時(shí),才用EtBr鍵結(jié)方法。(注意:EtBr為致癌劑,操作時(shí)務(wù)必帶手套,并禁止戴手套的手到處亂摸!)
 
溶媒萃取法
1. 儀器用具:
a. 桌上型離心機(jī)
b. 37℃恒溫箱
c. 排煙柜
2. 藥品及試劑:
a. phenol/chloroform = 1:1
b. chloroform/isoamylalcohol = 24:1
c. RNAse A:1mg/ml (100 加熱30分鐘去除DNase活性)
d. 100% ethanol
e. TE buffer
3. 方法步驟:
1) 由實(shí)驗(yàn)1中小量制備的DNA樣品,加入RNase A以去除RNA,其終濃度為10-20 mg/ml。
2) 加入50 ml TE buffer混合均勻。
3) 加入100 ml phenol (注意! phenol對(duì)皮膚具腐蝕性藥品,務(wù)必帶上手套并在排煙柜中操作),混合均勻使溶液形成混濁狀,這樣可以避免震蕩及攪拌時(shí)所產(chǎn)生的拉力將DNA弄斷。
4) 12,000 rpm離心20秒,小心用pipetman把上層液取出到另一離心管。
5) 加入100 ml phenol及100 ml chloroform以萃取剛才收集到的上層液,重復(fù)步驟4。
6) 加入200 ml chloroform萃取上層液,并重復(fù)步驟4。
 
濃縮質(zhì)體DNA
1.儀器用具:
a.桌上型離心機(jī)
b.真空干燥器
2.藥品及試劑:
a.3 M sodium Acetate (NaOAc), pH 5.2
b.100% ethanol
c.TE buffer
3.方法步驟:
1)加入1/10體積的sodium acetate于DNA溶液中,使其zui終濃度為0.3 M。
2)加入2.5倍體積100% Ethanol (EtOH)混合后,置于-20 中30~60分鐘(若DNA小于1kb或量少于100 ng/ml,應(yīng)把溶液放在-70 下2小時(shí),若DNA小于200 bp時(shí),加入10 mM MgCl2有助于DNA回收。)
3)12,000 rpm離心10分鐘,倒掉上清液,置于真空干燥器10分鐘。
4) 加50 ml TE buffer or water,再次懸浮DNA,保存樣品DNA于4 。

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