1.0 物品、試劑：
10ul及200ul tip頭、0.2ml PCR薄壁管、管架、手套；
DEPC處理水、Ex-Taq試劑盒（包括PCR Buffer、MgCl2、Taq酶）、DNA marker均另購(gòu)，
引物/dNTP混合物(primer/Nucleotide Mix)、陽(yáng)性對(duì)照DNA (Positive Control DNA)、內(nèi)標(biāo)DNA (Internal Control DNA) 為普飛生物提供的VenorGem試用裝中所含。
2.0實(shí)驗(yàn)方法：
2.1樣品的準(zhǔn)備：
樣品：細(xì)胞的新鮮培養(yǎng)物上清，小牛血清。
分別取兩種樣品各100ul至滅菌1.5ml離心管中，將管蓋蓋緊。置95℃保溫5分鐘，短暫離心（5 sec）。
2.2 試劑的溶解配制：
將裝有以下試劑干粉的離心管離心，向管中加入DEPC處理水，充分搖勻溶解后再短暫離心。以下為各組分的加水量：
引物/dNTP混合物 (Primer/Nucleotide Mix) 55ul
陽(yáng)性對(duì)照DNA (Positive Control DNA) 50ul
內(nèi)對(duì)照DNA (Internal Control DNA) 50ul
2.3 PCR混合物：
向0.2ml PCR薄壁管中依次加入以下組分，

PCR組分（單位：ul）
負(fù)對(duì)照管

內(nèi)對(duì)照管

陽(yáng)性

對(duì)照管

牛血清

檢測(cè)管

發(fā)酵液

檢測(cè)管

水

28.8

26.8

24.8

24.8

24.8

10×PCR Buffer

5

5

5

5

5

MgCl2（25mM）

6

6

6

6

6

引物/dNTP混合物

10

10

10

10

10

內(nèi)對(duì)照DNA

－

2

2

2

2

陽(yáng)性對(duì)照DNA

－

－

2

－

－

處理后樣品

－

－

－

2

2

Taq酶（5U/ul）

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

總體積

50

50

50

50

50

蓋緊管蓋，輕彈管壁混勻，稍加離心。
2.4熱循環(huán)程序：
將準(zhǔn)備好的PCR管放入PCR儀，運(yùn)行如下程序
94℃ 2min

1個(gè)循環(huán)

94℃ 30sec

35個(gè)循環(huán)

55℃ 30sec

72℃ 30sec

降溫至4~8℃

2.5凝膠電泳：
支原體PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)報(bào)告1.2％瓊脂糖凝膠電泳，TBE緩沖液，PCR產(chǎn)物及Marker均點(diǎn)樣5ul，于50V下電泳1hr，EB染色15min，紫外燈下觀察。
3.0結(jié)果分析：
電泳結(jié)果見(jiàn)圖。

圖中泳道M為DNA Marker，1為負(fù)對(duì)照管PCR產(chǎn)物，2為內(nèi)對(duì)照管PCR產(chǎn)物，3為陽(yáng)性對(duì)照管PCR產(chǎn)物，4為牛血清檢測(cè)管PCR產(chǎn)物，5為發(fā)酵液檢測(cè)管PCR產(chǎn)物。

負(fù)對(duì)照管PCR產(chǎn)物無(wú)帶，內(nèi)對(duì)照管在191 bp處有一條帶，陽(yáng)性對(duì)照管在278 bp處有一條帶，證明本次實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確可靠。兩樣品檢測(cè)管均只有一條與內(nèi)對(duì)照管相同位置的條帶，說(shuō)明樣品檢測(cè)管PCR反應(yīng)并未受到抑制，且不含支原體。