磁珠法分離純化不同大小的DNA-片段

 磁珠法是一種固相載體可逆化固定（SPRI）的分離純化方法，主要原理為：在不同濃度的PEG（polyethylene glycol；聚乙二醇）中，會(huì)有不同片段大小的DNA吸附在磁珠的羧基修飾層上，這些DNA可以再溶解在水中，以此來(lái)洗脫回收。

    實(shí)驗(yàn)使用的磁珠分為五層（圖1；直徑1微米），由內(nèi)而外依次為：聚苯乙烯材料的、順磁材料（主要為四氧化三鐵）、層聚苯乙烯材料、層順磁材料以及表面粗糙的羧基修飾層。粗糙的表面更利于核酸與羧基修飾層結(jié)合。

圖1.磁珠各層成分

 在整個(gè)體系中，PEG的濃度是影響DNA回收的決定性因素（其他因素還包括DNA大小和濃度、鹽離子濃度、作用時(shí)間等等）。DNA在濃度的PEG存在條件下，NaCl或MgCl2下，使DNA發(fā)生脫水反應(yīng)，分子構(gòu)象會(huì)發(fā)生急劇變化，由線狀被壓縮形成卷曲球狀，繼而聚集沉淀，同時(shí)隨PEG分子量、濃度以及鹽濃度的不同，不同長(zhǎng)度的DNA可以被選擇性的沉淀出來(lái)。在磁珠體系中，某些分子量（常用的是PEG8000）的PEG的功能主要是與鹽離子共同作用，改變不同長(zhǎng)度DNA的分子構(gòu)象，同時(shí)增加體系的粘稠程度，使磁珠在其中處于懸浮狀態(tài)，不易沉降，增加磁珠在空間位置的碰撞與排斥，從而增加核酸與磁珠的聚集效率與，除此之外，PEG與具有相容性，也可樣品中的。

圖2. 磁珠與DNA結(jié)合示意圖

當(dāng)前主流觀點(diǎn)認(rèn)為，處于PEG和鹽離子環(huán)境中的DNA，因脫水作用而發(fā)生分子構(gòu)象改變后，會(huì)暴露出磷酸骨架上大量的帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)，與表面帶負(fù)電荷的羧基磁珠結(jié)合。負(fù)負(fù)電荷之間的作用是由于帶正電荷的鹽離子的作用（如Na+；圖2）。帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)借由解離的鹽離子（如Na+）與羧基形成離子橋，使DNA被性吸附到羧基磁珠表面。當(dāng)PEG和鹽類被之后，加入水性分子，會(huì)充分水化DNA，解除其三者之間的離子相互作用，使得吸附到磁珠的DNA被純化出來(lái)。

操作的具體步驟如下圖3（0.6xDNA溶液體積的0.6倍；該倍數(shù)要依據(jù)各自不同的實(shí)驗(yàn)體系自行檢測(cè)調(diào)整）：

圖3.磁珠法分離400-600bp DNA-片斷的步驟

如果只是分離純化單條帶PCR產(chǎn)物，我們通常使用1.2x的磁珠，與PCR產(chǎn)物在EP管內(nèi)混合后放在磁力架上1分鐘，丟棄上清，70%酒精洗滌兩次后室溫干燥，然后將EP管從磁力架上取下，TE或者純水與磁珠混合，然后放回磁力架取上清，整個(gè)過(guò)程耗時(shí)約15分鐘。

磁珠DNA分離法中多次使用了磁力架，來(lái)使磁珠聚合并方便除去洗脫液。一般磁力架（針對(duì)EP管或者96孔PCR板）約1000-5000人民幣，而我們實(shí)驗(yàn)室（海洋大學(xué)海洋生物多樣性與進(jìn)化研究所-進(jìn)化基因組學(xué)研究室）能夠通過(guò)３D打印機(jī)自行打印并使用了稀土材料制作的高強(qiáng)永磁鐵，甚至好于商業(yè)化產(chǎn)品。具體制作方法我們會(huì)在之后的推送中介紹。

齊岳供應(yīng)：

上述產(chǎn)品齊岳生物均可供應(yīng)，用于科研！

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