小鼠單核巨噬細胞白血病細胞RAW 264.7細胞 原代培養(yǎng)
1．實驗前三天，向每只小鼠腹腔內(nèi)注入無菌硫羥乙酸肉湯1ml（勿注入腸內(nèi)）。
2．引頸殺死動物，手提鼠尾將全鼠浸入70％酒精中3～5秒。
3．置動物于解剖臺上，用針頭固定四肢，雙手持鑷撕開皮膚拉向兩側(cè)，暴露出腹膜，但勿傷及腹膜壁。
4．再用70％酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸10ml Eagle液注入腹腔中，同時從兩側(cè)用手指揉壓腹膜壁，令液體在腹腔內(nèi)充分流動。
5．用針頭輕輕挑起腹壁，使動物體微傾向一側(cè)，使腹腔中液體集于針頭下吸取入針管內(nèi)。
6．小心拔出針頭，把液體注入離心管中，250g 4℃離心10分鐘，去上清，加10 ml Eagle培養(yǎng)基。
7．計數(shù)細胞，每只小鼠可產(chǎn)生20～30×105細胞，其中90％為巨噬細胞。
8．為獲取3×105個帖附細胞/平方厘米，需接種2.5×106/ml。
9．為純化培養(yǎng)細胞，去除其它白細胞，接種數(shù)小時后，去除培養(yǎng)液，用Eagle液沖洗1～2次后，再加新Eagle培養(yǎng)液置37℃ CO2溫箱中培養(yǎng)。
小鼠單核巨噬細胞白血病細胞RAW 264.7細胞 原代培養(yǎng)通派細胞 細胞查詢：
人肺鱗癌瘤株LTEP-s
人肺鱗癌細胞NCI-H1703
人肺鱗癌細胞NCI-H2170
人非小細胞肺癌細胞NCI-H524
人肺腺癌細胞SPC-A1
人肺癌細胞A549
人非小細胞肺癌細胞H125
人肺癌細胞H1299
人肺癌細胞TKB-1
人肺腺癌細胞LTEP-a-2
人肺腺癌細胞Lu-165
人大細胞肺癌細胞NCI-H460
人肺腺癌細胞SPC-A-1
人高轉(zhuǎn)移肺癌細胞095-D
人肺鱗癌細胞SK-MES-1
人大細胞肺癌細胞NCI-H661
人肺黏液上皮樣癌細胞NCI-H292
人肺退行性癌細胞Calu-6
人肺腺癌細胞NCI-H1395
人非小細胞肺癌細胞NCI-H358
人非小細胞肺癌細胞HCC827
人典型小細胞肺癌細胞NCI-H1688
人非小細胞肺癌細胞NCI-H1299
人胚肺二倍體細胞2BS
人支氣管上皮樣細胞BEAS-2B
人胚肺成纖維細胞CCC-HPF-1
人胚胎氣管組織來源細胞CCC-HBE-2
人肺腺癌細胞Calu-3
人肺退行性癌細胞Calu-6
人小細胞肺癌細胞DMS 153
人高轉(zhuǎn)移肺癌細胞95-D
人低分化肺腺癌細胞GLC-82
人肺細胞HLF-a
人胚肺二倍體細胞HEL-1
人胚肺二倍體細胞HEL-2
人肺癌細胞H1299
人非小細胞肺癌細胞HCC827
人胚肺二倍體細胞KMB-17
人胚肺細胞系KuMA
人肺鱗癌細胞LTEP-s
人小細胞肺癌細胞LTEP-sm
人肺鱗癌瘤株LTEP-s
人肺腺癌細胞LTEP-a-2
人肺腺癌細胞Lu-165
小鼠單核巨噬細胞白血病細胞RAW 264.7細胞 原代培養(yǎng)一、原理
在不加任何條件下直接凍存細胞時，細胞內(nèi)和外環(huán)境中的水都會形成冰晶，能導致細胞內(nèi)發(fā)生機械損傷、電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水、PH改變、蛋白變性等，能引起細胞死亡。如向培養(yǎng)液加入保護劑，可使冰點降低。在緩慢的凍結(jié)條件下，能使細胞內(nèi)水份在凍結(jié)前透出細胞。貯存在－130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。
細胞復蘇時速度要快，使之迅速通過細胞zui易受損的－5～0℃，細胞仍能生長，活力受損不大。
目前常用的保護劑為二甲亞砜（DMSO）和甘油，它們對細胞無毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細胞。
二、操作步驟
（一）凍存
1、消化細胞（同實驗二），將細胞懸液收集至離心管中。
2、1000rpm離心10分鐘，棄上清液。
3、沉淀加含保護液的培養(yǎng)，計數(shù)，調(diào)整至5×106/ml左右。
4、將懸液分至凍存管中，每管1 ml。
5、將凍存管口封嚴。如用安瓿瓶則火焰封口，封口一定要嚴，否則復蘇時易出現(xiàn)爆裂。
6、貼上標簽，寫明細胞種類，凍存日期。凍存管外拴一金屬重物和一細繩。
7、按下列順序降溫：室溫→4℃（20分鐘〕→冰箱冷凍室（30分鐘）→低溫冰箱（－30℃ 1小時）→氣態(tài)氮（30分鐘）→液氮。
注意：操作時應(yīng)小心，以免液氮凍傷。液氮定期檢查，隨時補充，不能揮發(fā)干凈，一般30立升的液氮能用1～1.5月。
（二）復蘇
1、準備一個茶缸或1000ml的燒壞，內(nèi)裝2/3杯37℃的溫水。
2、從液氮中取出凍存管、迅速置于溫水中并不斷攪動。使凍存管中的凍存物在1分鐘之內(nèi)融化。
3、打開凍存管，將細胞懸液吸到離心管中。
4、1000rpm離心10分鐘，棄去上清液。
5、沉淀加10ml培養(yǎng)液，吹打均勻，再離心10分鐘，棄上清液。
6、加適當培養(yǎng)基后將細胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，37℃培養(yǎng)，第二天觀察生長情況。
三、試劑和器材
器材：液氮罐、凍存管（塑料螺口凍存管或安瓿瓶）、離心管、吸管、離心機等
試劑：0.25％胰酶、培養(yǎng)基、含保護劑的培養(yǎng)基（即凍存液）
附：凍存液配制：
培養(yǎng)基加入甘油或DSMO，使其終濃度達5—20%。保護劑的種類和用量視不同細胞而不同。配好后4℃下保存。
