一、目的要求
了解植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的基本原理，通過實(shí)驗(yàn)掌握植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的方法和技術(shù)。并通過實(shí)驗(yàn)練習(xí)和鞏固無菌操作技術(shù)。
二、基本原理
利用固體瓊脂培養(yǎng)基對植物的離體組織進(jìn)行培養(yǎng)的方法在植物遺傳實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用。但這種方法在某些方面還存在一些缺點(diǎn)，比如在培養(yǎng)過程中，植物的愈傷組織在生長過程中的營養(yǎng)成分、植物組織產(chǎn)生的代謝物質(zhì)呈現(xiàn)一個梯度分布，而且瓊脂本身也有一些不明的物質(zhì)成分可能對培養(yǎng)物產(chǎn)生影響，從而導(dǎo)致植物組織生長發(fā)育過程中代謝的改變而利用液體培養(yǎng)基則可以克服這一缺點(diǎn)，當(dāng)植物的組織在液體培養(yǎng)基中生長時，我們可以通過薄層震蕩培養(yǎng)或向培養(yǎng)基中通氣用以改善培養(yǎng)基中氧氣的供應(yīng)。植物細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)是指將植物細(xì)胞或較小的細(xì)胞團(tuán)懸浮在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中能夠保持良好的分散狀態(tài)。這些小的細(xì)胞聚合體通常來自植物的愈傷組織。
一般的操作過程是把未分化的愈傷組織轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中不斷進(jìn)行旋轉(zhuǎn)震蕩，一般可用100～12Or/min 的速度進(jìn)行。由于液體培養(yǎng)基的旋轉(zhuǎn)和震蕩，使得愈傷組織上分裂的細(xì)胞不斷游離下來。在液體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物是混雜的，既有游離的單個細(xì)胞，也有較大的細(xì)胞團(tuán)塊，還有接種物的死細(xì)胞殘?jiān)?br />在液體懸浮培養(yǎng)過程中應(yīng)注意及時進(jìn)行細(xì)胞繼代培養(yǎng)，因?yàn)楫?dāng)培養(yǎng)物生長到一定時期將進(jìn)入分裂的靜止期。對于多數(shù)懸浮培養(yǎng)物來說，細(xì)胞在培養(yǎng)到第18～25d 時達(dá)到zui大的密度，此時應(yīng)進(jìn)行*次繼代培養(yǎng)。在繼代培養(yǎng)時，應(yīng)將較大的細(xì)胞團(tuán)塊和接種物殘?jiān)?。若從植物器官或組織開始建立細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系，就包括愈傷組織的誘導(dǎo)、繼代培養(yǎng)、單細(xì)胞分離和懸浮培養(yǎng)。目前這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細(xì)胞的形態(tài)、生理、遺傳、凋亡等研究工作，特別是為基因工程在植物細(xì)胞水平上的操作提供了理想的材料和途徑。經(jīng)過轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再經(jīng)過誘導(dǎo)分化形成植株，即可獲得攜帶有目標(biāo)基因的個體。
三、器材
超凈工作臺、高壓蒸汽滅菌器、恒溫培養(yǎng)箱、磁力攪拌器、恒溫空氣搖床、鑷子、錐形瓶、水稻種子
四、操作步驟
1．配制培養(yǎng)基
(1) 用于誘導(dǎo)水稻愈傷組織的培養(yǎng)基(N6)，見表4－1。
(2) 用于水稻懸浮培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基，見表4－2。
按照培養(yǎng)基配方取各種藥品，zui后用蒸餾水定容到所需體積。所配制的培養(yǎng)基經(jīng)高壓蒸汽滅菌后備用，固體瓊脂培養(yǎng)基分裝在250mL 的錐形瓶內(nèi)，每瓶約分裝30mL。
2．水稻種子的消毒
（1）將種子置于無菌的培養(yǎng)皿內(nèi)，以體積分?jǐn)?shù)95％的酒精消毒1～2min。
（2）取出后用無菌水沖洗2～3 遍。
（3）將種子放入25.0g/L 的次氯酸鈉溶液中輕輕搖動后，浸泡60min 。
（4）取出后用無菌水沖洗，將次氯酸鈉溶液充分洗凈。
3. 接種
在超凈工作臺內(nèi)，將滅菌后的水稻種子接到誘導(dǎo)愈傷組織的固體培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)瓶接5～10 粒種子。接種完畢后用封口膜將培養(yǎng)瓶封好，放在26℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行黑暗培養(yǎng)。
表4－1 用于誘導(dǎo)水稻愈傷組織的培養(yǎng)基

表4－2 用于水稻懸浮培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基
植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)
4．懸浮培養(yǎng)的開始：
當(dāng)?shù)玫接鷤M織后，將其轉(zhuǎn)人到AA 液體培養(yǎng)基中。注意愈傷組織塊應(yīng)小于3mm . 若組織塊較大可用無菌解剖刀將其分割成小塊。液體培養(yǎng)基分裝在250mL 的錐形瓶內(nèi)．接種完畢后將瓶口用封口膜封好，把培養(yǎng)瓶放到恒溫?fù)u床上進(jìn)行震蕩培養(yǎng)。調(diào)整搖床的旋轉(zhuǎn)速度，使之為120r/min。培養(yǎng)溫度為26℃，在黑暗中培養(yǎng)。
5．懸浮培養(yǎng)物的保持
進(jìn)行懸浮培養(yǎng)后要不斷進(jìn)行觀察，由于培養(yǎng)物的繼代培養(yǎng)與培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)物的密度及細(xì)胞生長速度有關(guān)，因此當(dāng)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)物密度較大時，應(yīng)及時用無菌的吸管吸取部分培養(yǎng)物到一新的50mL 培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。同時還要及時淘汰一些大的組織團(tuán)塊和黃褐色的壞死組織。一般每隔4～7d 就要繼代一次。