DNA克隆技術(shù)是70年代分子生物學(xué)發(fā)展的重大成果，用限制性內(nèi)切酶直接切割分離某個(gè)外源DNA片段，與此同時(shí)用同一種限制性內(nèi)切酶切割載體DNA，兩個(gè)DNA產(chǎn)生同樣的粘性末端，將它們混合后，二者的粘性末端通過(guò)堿基間氫鍵配對(duì)而互補(bǔ)。然后在T4DNA連接酶作用下，使外源DNA片段和載體連接而成為完整的重組DNA分子。

現(xiàn)在使用的許多載體都帶有一個(gè)大腸桿菌DNA的短區(qū)段，其中含有β-半乳糖苷酶基因的調(diào)控序列和N端146個(gè)氨基酸的編碼信息。宿主的染色體上帶有β-半乳糖苷酶C端的編碼序列。宿主和質(zhì)粒編碼的片段各自都不具有酶活性，但它們可以結(jié)合為一體，形成具有酶活性的蛋白質(zhì)。這樣，質(zhì)粒載體與LacZ基因上缺失近操縱基因區(qū)段的β-半乳糖苷酶陰性的大腸桿菌突變體之間實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)，這種現(xiàn)象稱為α-β-D-半乳糖苷存在下形成藍(lán)色菌落。當(dāng)外源dna片段插入到質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)后，將產(chǎn)生無(wú)α互補(bǔ)能力的質(zhì)粒，由這種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌形成白色菌落。

抗生素平板選擇標(biāo)記：

ppUC19質(zhì)粒帶有氨芐青霉素抗性基因，而JM109宿主菌對(duì)氨芐青霉素沒(méi)有抗性。在用pUC19質(zhì)粒轉(zhuǎn)化JM109后，涂布到含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，沒(méi)有被轉(zhuǎn)化的菌不能生長(zhǎng)，而被轉(zhuǎn)化了的菌可以正常生長(zhǎng)，形成菌落。

β-半乳糖苷酶系統(tǒng)篩選(藍(lán)、白斑篩選)：

pUC19質(zhì)粒帶有一個(gè)大腸桿菌DNA的短區(qū)段, 其中含有β-半乳糖苷酶基因(Lac Z)的調(diào)控序列和頭146個(gè)氨基酸的編碼信息。JM109宿主菌染色體上帶有Lac Z的C端部分編碼信息，它們編碼的肽段各自都不具有酶活性, 但它們?cè)谕患?xì)胞內(nèi)可以通過(guò)非共價(jià)鍵結(jié)合起來(lái), 形成具有β-半乳糖苷酶活性的蛋白質(zhì)。質(zhì)粒載體與Lac Z基因上缺失近操縱基因區(qū)段的β-半乳糖苷酶陰性的大腸桿菌突變體之間的這種互補(bǔ)作用稱為α互補(bǔ)。

1實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/em>

掌握CaCl2法將載體(質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化入受體(大腸桿菌)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)

2 實(shí)驗(yàn)步驟：

2.1 配選擇培養(yǎng)基平板：

2.1.1 LB液體培養(yǎng)基: 1g蛋白胨, 0.5g酵母粉, 1g NaCl, 加重蒸水100ml，用NaOH調(diào)pH至7.0，高壓滅菌。(每組配50ml)

2.1.2 LB固體培養(yǎng)基: 在40ml未高壓滅菌的LB液體培養(yǎng)基中加1.5%瓊脂，高壓滅菌后取出。當(dāng)培養(yǎng)基冷卻到約50℃時(shí)，加入氨芐青霉素母液(500mg/ml)，使其終濃度為200μg/ml，搖勻后迅速倒成兩個(gè)平板。(高壓滅菌同時(shí)也滅菌兩套洗凈的培養(yǎng)皿)

2.1.3 在超凈工作臺(tái)上，往倒好的每個(gè)平板培養(yǎng)基上涂布40μl X-gal貯備液(80mg/ml)和4μl IPTG貯備液(200mg/ml)，將平板置于室溫放置3-4h直至液體被吸收。

2.2 制備感受態(tài)細(xì)胞

2.2.1 取大腸桿菌JM109劃線培養(yǎng)過(guò)夜的單菌落接種到20mlLB液體培養(yǎng)基中，置37℃搖床于280rpm振搖培養(yǎng)約6h。

2.2.2 將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個(gè)無(wú)菌離心管中，冰上放置10min，使培養(yǎng)物冷卻到0℃。

2.2.3 以4000rpm離心10min，回收細(xì)胞，棄上清，將管倒置使殘留的痕量培養(yǎng)液盡量流盡。

2.2.4 以1.5ml冰冷的0.1mol/L CaCl2懸浮沉淀，放置于冰浴。

2.2.5 以2000rpm離心10min，回收細(xì)胞且使培養(yǎng)液流盡。

2.2.6 取1ml冰冷的0.1mol/L CaCl2懸浮細(xì)胞，將細(xì)胞分成200μl一份，裝入Eppendorf管中，置4℃冰箱備用。此時(shí)的細(xì)胞為感受態(tài)細(xì)胞。

2.3 轉(zhuǎn)化

2.3.1 取2管200μl的感受態(tài)細(xì)胞，1管中加入50 ng pUC19的DNA，另1管為不加質(zhì)粒DNA的對(duì)照，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，冰上放置30min。

2.3.2 將管放到42℃水浴中1.5min，不要搖。然后在冰浴中迅速冷卻 2min。(熱激反應(yīng))

2.3.3 每管加入100μl LB培養(yǎng)基，37℃水浴中溫育45min。

2.4 培養(yǎng)

2.4.1 取200μl菌液加在含有氨芐青霉素及X-Gal和IPTG的選擇平板培養(yǎng)基上，用一無(wú)菌彎頭玻棒輕輕將細(xì)菌涂在瓊脂平板表面，將平板置于室溫直至液體被吸收。經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)菌和未轉(zhuǎn)化的對(duì)照各涂布一個(gè)平板。

2.4.2倒置平皿37℃培養(yǎng)12-16h，對(duì)照培養(yǎng)皿中應(yīng)無(wú)菌落出現(xiàn)，涂布有經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌的培養(yǎng)皿中長(zhǎng)出藍(lán)色菌落。

2.4.3 第二天上午觀察結(jié)果，記錄現(xiàn)象，并大致估計(jì)各皿的菌落數(shù)。