農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞的制備

1.挑取少許農(nóng)桿菌LBA4404，接種于5ml LB液體培養(yǎng)基 (含50mg/L STR)中，28℃、200r/mim培養(yǎng)過夜。

2.取2ml培養(yǎng)物于LB液體培養(yǎng)基 (含50mg/L STR) 中繼續(xù)培養(yǎng)，直至OD800 為0.5左右。

3.將培養(yǎng)物置冰浴中30min，4℃、5000r/min、離心5min，棄去上清液。

4.用10ml冷的0.1mol/L NaCl懸浮菌液。

5.4℃、5000r/min，離心5min，棄去上清液。

6.用1ml冷的CaCl2 (20mmol/L)懸浮，分裝成50μl/管，液氮中冷凍后至-80℃保存。

農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞的制備：

1.試劑配制：solution1 ： Rbcl 1.21g 100mM

MgCl2.4H2O 1.02g 50mM

K-Acetate 0.29g 30mM

CaCl2.2H2O 0.15g 10mM

Glycerol 15% 15ml，定容至100ml。

pH=5.8，121度，高壓滅菌30min。

solution2： Rbcl 0.12g 10mM

K-Acetate 0.1g 10mM

CaCl2.2H2O 1.1g 75mM

Glycerol 15% 15ml，定容至100ml。

pH=5.8，121度，高壓滅菌30min。

2.農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞的培養(yǎng)：

15-20ml無抗生素的lb培養(yǎng)基，用牙簽挑取農(nóng)桿菌放入小三角瓶中，28度120轉(zhuǎn)震蕩培養(yǎng)過夜。(注意牙簽和小三角瓶均需滅菌)

3.制備感受態(tài)農(nóng)桿菌：把已培養(yǎng)過夜的小三角瓶中的農(nóng)桿菌分裝到1.5ml小離心管中，室溫下，4，000g，離心10min。棄去上清，每管加0.5ml solution1，用手指彈管底部，以使菌體懸浮。冰上放置15mim-2h。4度，4，000g，

離心10min。取出后放在冰上，棄去上清，每管加0.5ml solution2，用手指彈管底部，以使菌體懸浮，冰上放置15mim。分裝 感受態(tài)農(nóng)桿菌 ，每管可分裝3-4管。用液氮速凍后至-80℃冰箱中保存。