western blot 的實驗原理及操作步驟

2025年04月08日 10:39上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司點擊量：180

原理
Western Blot與Southern印跡雜交或Northern印跡雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素膜NC膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達。

分類
Western Blot顯色的方法主要有以下幾種： i. 放射自顯影 ii. 底物化學(xué)發(fā)光ECL iii. 底物熒光ECF iv. 底物DAB呈色現(xiàn)常用的有底物化學(xué)發(fā)光ECL和底物DAB呈色，體同水平和實驗條件的是用第一種方法，目前發(fā)表文章通常是用底物化學(xué)發(fā)光ECL。只要買現(xiàn)成的試劑盒就行，操作也比較簡單，原理如下（二抗用HRP標(biāo)記）：反應(yīng)底物為過氧化物+魯米諾，如遇到HRP，即發(fā)光，可使膠片曝光，就可洗出條帶。

其他
值得一提的是，western blot 這個名稱的由來很有意思。最開始做印跡工作的是一個叫做Southern的科學(xué)家，但印跡的對象是DNA鏈，他把這種技術(shù)稱為Southern blot，后來類似的出現(xiàn)了兩個過程相似，但是對象不同的印跡方法，一個針對RNA，一個對蛋白質(zhì)，人們分別把這兩種技術(shù)的稱為Northern和Western，與這兩個技術(shù)的發(fā)明人沒有關(guān)系了。

western blot的實驗步驟及注意事項
1. 把聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上。
1）轉(zhuǎn)移緩沖液洗滌凝膠和硝酸纖維素膜，將硝酸纖維素膜鋪在凝膠上，用5ml移液管在凝膠上來回滾動去除所有的氣泡。
2）在凝膠/濾膜外再包一張3mm濾紙（預(yù)先用轉(zhuǎn)移緩沖液浸濕），將凝膠夾在中間，保持濕潤和沒有氣泡。
3）將此濾紙/凝膠/薄膜濾紙按照廠家建議方法放入電泳裝置中，凝膠面向陰極。
4）將上述裝置放入緩沖液槽中，并灌滿轉(zhuǎn)移緩沖液以淹沒凝膠。
5）按照廠家所示接通電源開始電泳轉(zhuǎn)移。
6）轉(zhuǎn)移結(jié)束后，取出薄膜和凝膠，棄去凝膠。
2. 將薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量標(biāo)準(zhǔn)顯現(xiàn)時取出，記錄下標(biāo)準(zhǔn)位置。
3. 用100ml水洗滌纖維素膜，必要時可用脫色緩沖液。
4. 膜置印跡緩沖液中于37℃保溫1小時。
5. 室溫下，用PBS-Tween緩沖液洗滌薄膜。
6. 用封口機將薄膜封入塑料袋中，盡可能不留空氣。
7．袋的一角剪一緩沖液的小口，用透析袋夾緊。
8．混合：NGS(100微升)，印跡緩沖液中的抗體（10毫升），加在裝薄膜的袋中，于室溫下?lián)u動2小時（或4℃過夜）
9．用總體積300ml PBS-Tween緩沖液，分4次在一淺盤中洗滌薄膜，每次75ml。
10. 將連接生W物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升 NGS）加在袋內(nèi)，于室溫下?lián)u動1小時。
11．按步驟9洗滌。
12．加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升 NGS），于室溫下?lián)u動。

注意事項：
western blot中轉(zhuǎn)移在膜上的蛋白處于變性狀態(tài)，空間結(jié)構(gòu)改變，因此那些識別空間表位的抗體不能用于western blot檢測。這種情況可以將表達目的蛋白的細(xì)胞或細(xì)胞裂解液中的所有蛋白先生w物素化，再用酶標(biāo)記親和素進行western blot。實驗中取膠和膜需帶手套。

關(guān)鍵詞：封口機

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