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進口ELISA試劑盒價格實驗時常遇到的問題分析

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進口ELISA試劑盒價格實驗時常遇到的問題分析
1 試劑空白
試劑空白吸光度是反映試劑質量的指標之一。每種試劑都有一定的空白吸光度范圍,試劑空白吸光度的改變往往提示該試劑的變質;如利用Trinder反應為原理的檢測試劑會因含酚類物質被氧化為醌而變?yōu)榧t色。堿性磷酸酶、r一谷氨酰轉肽酶、*等檢測試劑會因基質分解出硝基酚或酚基苯胺而變黃。有些試劑久置后變渾濁。這些情況均可使空白吸光度升高。*氨基轉移酶、天冬氨酸氨基轉移酶等負反應,在放置過程中其試劑空白吸光度會因NADH自行氧化為NAD+而下降。原則上,吸光度上升的反應,其試劑空白吸光度越低越好,不能超過一個高限;相反,吸光度下降的反應,其試劑空白吸光度不能低于一個低限。因此,試劑空白吸光度限值,常作為程序參數輸入儀器,如經核查超限,儀器會自動報警,提示更換試劑。需要指出的是,還原型輔酶I(或II)等投料量不足或劣質的原料,往往需要加大用量,才使“表觀”吸光度上升,湊合過試劑空白核對的“關”,其后果為如下情況:
1.1 線性范圍變窄 現象:高值測不高。原因:試劑時有效成分投料量不足;試劑成份穩(wěn)定性較差。
1.2 靈敏度變低現象:酶促反應速度曲線斜率下降,測定結果有嚴重系統(tǒng)誤差。原因:試劑底物濃度不足。
1.3 低值偏高 現象:試劑空白的變化曲線(吸光度VS時間)明顯波動。原因:試劑自身不穩(wěn)定,自行分解;工具酶純度不夠,雜酶含量超限,導致干擾作用。
2 樣品信息
樣品的溶血、脂血、黃疸等會對測定結果產生非化學反應的干擾。因此,應根據溶血、脂濁、黃疸的光譜吸收特性,采用雙波長或多波長的檢測模式,并在結果計算中扣除因溶血、脂血、黃疸引起的影響,減少干擾程度。
3 elisa試劑盒測定范圍
每種待測物都有一個可測定的濃度或活性范圍,樣品結果若超過此范圍,分析儀將顯示結果超過范圍的提示。表示試劑已經變質,應更換合格試劑。
4 底物耗盡
使用連續(xù)監(jiān)測法、兩點法測定酶活性時,若酶活性非常高,底物接近被耗盡,吸光度上升或下降會超過某一吸光度變化范圍,監(jiān)測期的吸光度將偏離線性,使測定結果不可靠。
5 酶的預活化
測定血清中的某些酶,如CK,離體(采血)后很容易失活。失活的原因是酶活性中心的活性基因巰基(一SH)被氧化造成的。只有通過適當的還原作用才能重新激活。如CK—NAC試劑盒即含有CK活化劑,名為N一乙酰半*。實驗研究證明,NAC對血清中已失活的CK活化過程約需180 S。這就是CK測定為什么要延遲時間較長的理論依據。在AST,ALT采用IFCC*方法測定時需要磷酸吡哆醛預活化。需要強調:含有活化劑的生化試劑,其測定酶活性的結果要高些。
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