2016年3月8號星期五，我司銷售部業(yè)務(wù)員王接到來自廣西醫(yī)科大學(xué)的劉同學(xué)的咨詢來電，劉同學(xué)不久后將面臨論文答辯。劉同學(xué)導(dǎo)師給予她一個月完成人2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)ELISA的實驗。但由于之前沒有接觸過該實驗，對于ELISA實驗如何作標準曲線圖表示很茫然。在了解到該情況后，吳讓我司技術(shù)部發(fā)來關(guān)于做標準曲線圖的詳細相關(guān)介紹供劉同學(xué)參考。在此也希望能夠幫助到遇到同樣有這個問題的客戶。以下是關(guān)于ELISA實驗標準曲線圖的注意事項及擬合方程的選擇：
1、樣品的濃度等指標是根據(jù)標準曲線計算出來的，所以首先要把做標準曲線看作是比做正式實驗還要重要的一件事，否則后面的實驗結(jié)果無從談起。
2、設(shè)置標準曲線樣品的標準濃度范圍要有一個比較大的跨度，并且要能涵蓋你所要檢測實驗樣品的濃度，即樣品的濃度要在標準曲線濃度范圍之內(nèi)，包括上限和下限。而對于呈S型的標準曲線，盡量要使實驗樣品的濃度在中間坡度zui陡段，即曲線幾乎成直線的范圍內(nèi)。
3、采用倍比稀釋法配制標準曲線中的標準樣品濃度，這樣就能夠保證標準樣品的濃度不會出現(xiàn)較大的偏離。
4、檢測標準樣品時，應(yīng)按濃度遞增順序進行，以減少高濃度對低濃度的影響，提高準確性。
5、標準曲線的樣品數(shù)一般為7個點，但至少要保證有5個點。
6、做出的標準曲線相關(guān)系數(shù)因?qū)嶒炓蟛煌兴儎?，但一般來說，相關(guān)系數(shù)R至少要大于0.98，對于有些實驗，至少要0.99甚至是0.999.
標準曲線圖的擬合方程
在S曲線的低濃度部門可以用乘冪方程很好的擬合，中低濃度部門可以用直線方程，中間部門可用對數(shù)方程，而中后段可用四參數(shù)。免疫檢測時尺度點（可以是倍比稀釋的，也可以不是）濃度假如和相應(yīng)的吸光度（OD）值假如能夠呈現(xiàn)直線關(guān)系當(dāng)然是的了，這時可以通過EXELL等利便的獲得擬合曲線，進而推算出樣品的濃度值。
關(guān)于尺度曲線的擬合方式，直線、二次曲線、三次曲線、指數(shù)、對數(shù)等雖都可用于ELISA及其它生物學(xué)反應(yīng)中的曲線擬合，但都只合用于曲線的一部分，有的合用于前半段，有的合用于后半段，有的合用于中間一段，而Logistic曲線則對曲線的全部都有較好的合用性。在一個長的區(qū)間內(nèi)，Logistic應(yīng)該都能擬合得較為理想。假如用來定量，S形曲線的中間段（較陡處）是比較好的，而兩真?zhèn)€平坦部門計算誤差會大，有時甚至?xí)艽蟆Ｓ糜诿庖邫z測的所謂“尺度曲線”實在稱為擬合曲線比較合適。目前上zui流行的免疫檢測擬合方式是“四參數(shù)邏輯擬合”，用這種擬合方式往往能夠比較的反映濃度和吸光度的曲線關(guān)系，從而進一步比較準確的獲得樣品中待測物質(zhì)的濃度值。但我們做免疫檢測很少有時候能夠有這么理想的情況，標品濃度和相應(yīng)OD值往往是"S"型的曲線關(guān)系，這時就不能用直線擬合的方式了，而對擬合方法進行選擇就是必要的了。
