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原代細胞的分離和制作的消化分離法的操作步驟

閱讀:547發(fā)布時間:2015-5-21

1)剪切把組織塊剪碎,呈1~5mm3大小的組織塊。
2)加液漂洗將碎組織塊在平皿(或三角燒瓶)中用無鈣鎂PBS2-3次(采用傾斜,自然沉降法)。
3)消化加入消化液(*膠原酶EDTA)于37℃水浴中作用適當時間(中間可輕搖1~2次),若組織塊膨松呈絮狀可終止,若變化不大可更換一次消化液,繼續(xù)消化直至膨松絮狀為止。*消化時間不宜過長。
4)棄去消化液采用傾斜自然沉降或低速離心法盡量棄去消化液。
5)漂洗 將含有鈣、鎂離子的培養(yǎng)基沿瓶壁緩緩加入,中止消化反應,采用漂洗法洗2-3次后,加入*培養(yǎng)基。
6)機械分散采用吸管吹打或振蕩法,使細胞充分散開后用紗網(wǎng)或3~4層無菌紗布過濾后分瓶培養(yǎng),若要求不高可采用傾斜自然沉降5~10分鐘,吸上層細胞懸液進行分瓶培養(yǎng)。

注意事項如下:
1)組織塊必須漂洗2-3次以除去組織中的鈣、鎂離子和血清對*和EDTA的抑制作用。
2)胰蛋白濃度不宜過高,作用時間不能太長,以避免毒性作用。

3)消化后組織不僅要盡量棄去消化液,以避免毒性產生,而且動作要輕,以避免膨松的細胞隨漂洗而丟失。


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