多聚精氨酸—胞嘧啶脫氨酶融合蛋白的制備

西安齊岳生物科技有限公司是國內(nèi)的抗體偶聯(lián)科研（ADCs）、納米顆粒、PEG衍生物；支化聚合物生產(chǎn)制造商;提供的產(chǎn)品有

外源蛋白單鏈抗體ML3.9(scFv-ML)
人源化IL-2素
素T-CUS
Anti-HER-2-SEC2融合素
人源化抗P185~(HER-2)單區(qū)抗體
Anti-HER2 Fab'修飾包裹素蛋白PE38KDEL的靶向納米粒
靶向HER2和包裹PE38KDEL的PLGA納米球
蜂素與基因變構(gòu)人白細(xì)胞介素-2融合基因
針對(duì)HER2靶點(diǎn)的抗體科研
2E8-NCTD素
靶向EGFR隱蔽表位的素
表皮生長(zhǎng)因子受體EGFR和HER2配體寡肽
Anti-HER3抗體
多聚精氨酸—胞嘧啶脫氨酶融合蛋白
靶向nAChR激動(dòng)劑和基于骨架遷躍的EGFR/HER-2劑
L型氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)子1(LAT1)和磷酸化s6(phospho-s6,p-s6)核糖體蛋白
多聚精氨酸—胞嘧啶脫氨酶融合蛋白抗活性
抗SSA/Ro 60kDa抗原表位性單克隆抗體
重組人源抗--CTGF scFv二聚體
抗人CD19分子的嵌合抗原受體
融合基因anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-CD3(ζ)
二硫鍵穩(wěn)定的抗CD3/抗CD 19 (ds-Diabody)微型雙功能抗體
鼠抗人CD14新克隆ZCH-7-2F9單鏈抗體
抗CD20單鏈抗體
anti-PD-1(scFv)/IL-15/IL-15Rα-sushi(簡(jiǎn)稱PD-S15)
多肽修飾載紫杉醇PLGA微球
BMP2活性多肽/PLGA復(fù)合物
多肽RADA16-P24-PLGA共聚物
穿膜肽修飾的PLGA納米粒
透膜肽修飾的載流感泰得PLGA納米粒
鹿茸多肽-FK506-PLGA復(fù)合膜
穿透肽修飾的載姜黃素PLGA納米粒
RGD多肽化學(xué)修飾聚苯乙烯培養(yǎng)板
RGD多肽表面修飾HA-TCP生物陶瓷
PGA-RGD靶向性的基因載體遮蔽材料
RGD-PGAPMA聚合物
RGD多肽修飾SLA鈦片
RGD多肽修飾芬維A銨脂質(zhì)體
精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）多肽修飾多孔鉭材料
RGD多肽修飾的無機(jī)小牛骨粉
RGD多肽修飾氨基化聚乙二醇活性氧
RGD多肽介導(dǎo)阿霉素-樹枝狀聚合物
RGD多肽摻雜聚吡咯-銦錫氧化物（RGD-ITO）
RGD序列肽修飾絲素蛋白仿生支架材料
RGD多肽偶聯(lián)的酞菁硅光敏劑

多聚精氨酸—胞嘧啶脫氨酶融合蛋白的制備

等生物大分子在許多的發(fā)生和中發(fā)揮著重要作用，但是根據(jù)類藥五規(guī)則[1]，通常認(rèn)為類科研具有很差的滲透性。使得這類有價(jià)值但無細(xì)胞膜穿透性且易降解的親水性分子在細(xì)胞生物學(xué)、藥學(xué)等研究領(lǐng)域中的應(yīng)用大大。長(zhǎng)久以來研究人員致力于探索將這些效應(yīng)分子導(dǎo)入活細(xì)胞的方法。常用的方法有：物理方法，如電穿孔[2]、顯微[3]等；生物及化學(xué)方法，如洋地黃皂苷處理法[4]、成孔法[5]等；其他方法，如運(yùn)用素等載體[6]、顆粒(如脂質(zhì)體)包裹法[7]和載體[8]等。盡管這些方法各有特點(diǎn)，但都存在分子導(dǎo)入率低、易造成細(xì)胞損傷甚死亡、操作復(fù)雜和難于調(diào)控等問題。 細(xì)胞穿膜肽（cell pnentrating peptides，CPPs）又稱蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(protein transductingdomain)、特洛伊肽(Trojan peptides)。通常含有5-30個(gè)氨基酸，與其他多肽不同的是，細(xì)胞穿膜肽可以通過無細(xì)胞性、受體介導(dǎo)自由地導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)部，且不會(huì)造成細(xì)胞損傷。細(xì)胞穿膜肽的發(fā)現(xiàn)為生物大分子用于帶來了曙光，在細(xì)胞生物學(xué)、科研體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、臨床藥效評(píng)價(jià)及細(xì)胞學(xué)等研究領(lǐng)域均具有的應(yīng)用前景。目前*以細(xì)胞穿膜肽多聚精氨酸為簡(jiǎn)單。 胞嘧啶脫氨酶（Cytosine Deaminase，CD）是基因中的。胞嘧啶脫氨酶可轉(zhuǎn)化無細(xì)胞性的前導(dǎo)科研5氟胞嘧啶（5-fluorocytosine，5-FC）為化療科研5氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）。5氟尿嘧啶可通過胸苷酸合成酶的活性DNA的復(fù)制繼而引起細(xì)胞凋亡。 所用胞嘧啶脫氨酶，為來源于大腸桿菌的原核胞嘧啶脫氨酶及其突變體。此突變體在的原核胞嘧啶脫氨酶的316位苯丙氨酸和317為天冬氨酸突變?yōu)榘牒透拾彼?。突變后的原核胞嘧啶脫氨酶可?duì)5氟胞嘧啶的轉(zhuǎn)化效率，表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑作用。 本實(shí)驗(yàn)在原pSUMO載體的基礎(chǔ)上構(gòu)建pSUMO-R9-EGFP，將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosett（aDE3），經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后通過SDS-PAGE比較SUMO-EGFP及SUMO-R9-EGFP表達(dá)量及可溶性的差異。用Ni-NTA親和層析柱純化SUMO-R9-EGFP，并利用SUMOprotease I切去SUMO標(biāo)簽，終獲得純度較高的R9-EGFP成熟蛋白。以HepG2細(xì)胞為靶細(xì)胞，以EGFP為對(duì)照，利用流式細(xì)胞儀及激光共聚焦檢測(cè)R9-EGFP的穿膜，結(jié)果顯示獲得的成熟R9-EGFP可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，并聚集于細(xì)胞核內(nèi)，而EGFP無此功能。同時(shí)R9-EGFP的穿膜效率呈時(shí)間、劑量依賴性，可被肝素。 在pSUMO-R9-EGFP質(zhì)粒EGFP的位置插入原核胞嘧啶脫氨酶及其突變體，成功表達(dá)并純化多聚精氨酸-原核胞嘧啶脫氨酶及多聚精氨酸-原核胞嘧啶脫氨酶突變體等融合蛋白。以HepG2細(xì)胞及U251細(xì)胞為靶細(xì)胞，以單原核胞嘧啶脫氨酶為對(duì)照，利用MTT比色法檢測(cè)兩種融合蛋白的細(xì)胞活性。結(jié)果顯示兩種融合蛋白均具有細(xì)胞性，且突變體優(yōu)于的原核胞嘧啶脫氨酶，單原核胞嘧啶脫氨酶無細(xì)胞性，差異極。 以小鼠肝細(xì)胞H22為動(dòng)物模型，皮下多聚精氨酸-原核胞嘧啶脫氨酶及多聚精氨酸-原核胞嘧啶脫氨酶突變體等融合蛋白，腹部5氟胞嘧啶進(jìn)行。結(jié)果顯示兩種融合蛋白均具有抗活性，與未組和單胞嘧啶脫氨酶組相比，融合蛋白組可延長(zhǎng)小鼠存活時(shí)間8-10天。經(jīng)病理切片觀測(cè)，經(jīng)多聚精氨酸-原核胞嘧啶脫氨酶及多聚精氨酸-原核胞嘧啶脫氨酶突變體后的較對(duì)照組壞死嚴(yán)重。

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