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PCR和DNA序列分析基礎(chǔ)上產(chǎn)生的RFLP技術(shù)
閱讀：285 發(fā)布時(shí)間：2023-7-13不同核糖體RNA 基因的PCR-RFLP分析只要內(nèi)切酶選擇合適，細(xì)菌分類中的作用不同。16SrDNA PCR-RFLP細(xì)菌分類中應(yīng)用*的快速分群方法。這一分析中。分析結(jié)果則與16SrDNA 序列分析結(jié)果具有很好的一致性。許多研究結(jié)果標(biāo)明，16SrDNA PCR-RFLP指紋圖譜具有種的特異性，與數(shù)值分類和DNA 同源性分析同時(shí)使用，可較好地對(duì)細(xì)菌進(jìn)行種水平的分類。23SrDNA 比16SrDNA 分子量大，包括更多的遺傳信息，但將其應(yīng)用于分類并不像16SrDNA 那樣普遍和成熟。Terefework等對(duì)不同種的根瘤菌菌株進(jìn)行了23SrDNA PCR-RFLP和16SrDNA PCR-RFLP分析，兩種分析技術(shù)的結(jié)果具有較好的一致性，但對(duì)不同種發(fā)育地位的確定仍存在一定的差異，因此認(rèn)為23SrDNA PCR-RFLP分析在細(xì)菌分類中的作用還無(wú)法做出最后的結(jié)論。16SrDNA 23SrDNA 基因的間隔區(qū)序列(intergenspaceIGS一種多拷貝的DNA 短片段，其長(zhǎng)度和序列的變異水平大，將其擴(kuò)增后用多位點(diǎn)內(nèi)切酶消化可得出種、亞種、生物型甚至菌株水平特異的DNA 指紋圖譜用于分類。IGS-RFLP分析比23SrDNA PCR-RFLP和16SrDNA PCR-RFLP分析更靈敏，近年來(lái)在細(xì)菌種及種以下水平的分類鑒定中應(yīng)用得越來(lái)越普遍。
rDNA PCR-RFLP分析不只具有PCR簡(jiǎn)單快速、樣品用量少、可直接從細(xì)胞中擴(kuò)增的特點(diǎn)。普通的實(shí)驗(yàn)室中即可進(jìn)行，同時(shí)防止了高貴的序列分析費(fèi)用和放射性同位素的使用。因此這一方法已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌的鑒定、分類和物種多樣性的研究中。
PCR-RFLP聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)連接的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析的簡(jiǎn)稱。PCR和 DNA 序列分析基礎(chǔ)上產(chǎn)生的RFLP技術(shù)。該方法是通過(guò) PCR擴(kuò)增一段 DNA 片段。消化 PCR產(chǎn)物，然后再選擇適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶。經(jīng)電泳，可得到有特異性的電泳譜帶，從而達(dá)到鑒定不同基因型的目的
合成目的DNA 片段的新互補(bǔ)鏈。如此經(jīng)過(guò)n個(gè)周期，理論上擴(kuò)增2n倍,可使目的DNA 片段得以迅速擴(kuò)增。其主要步驟是將待擴(kuò)增的模板DNA 置于高溫(約93℃-95℃)下使之變性解鏈；人工合成的兩個(gè)寡核苷酸引物在低溫(約50℃-70℃)下分別與目的DNA 片段兩側(cè)的互補(bǔ)序列復(fù)性結(jié)合；引物在DNA 聚合酶作用（約70℃-75℃）下沿模板按53方向延伸。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR模擬體內(nèi)DNA 復(fù)制條件在體外酶促合成特異DNA 片段的循環(huán)反應(yīng)。一般PCR經(jīng)30-40周期后可獲得百萬(wàn)倍以上的目的DNA
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)—限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)（PCRRFLP分析技術(shù)是PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的DNA 堿基置換正好發(fā)生在某種限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)上。利用這一酶切性質(zhì)的改變，使酶切位點(diǎn)增加或者消失。PCR特異擴(kuò)增包括堿基置換的這段DNA 經(jīng)某一限制酶切割，再利用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物，與正常比較來(lái)確定是否變異。應(yīng)用PCRRFLP可檢測(cè)某一致病基因已知的點(diǎn)突變，進(jìn)行直接基因診斷，也可以此為遺傳標(biāo)志進(jìn)行連鎖分析進(jìn)行間接基因診斷。
一般而言。用現(xiàn)有限制性內(nèi)切酶酶解得到片段太多，細(xì)菌的基因組DNA 較大。且比較復(fù)雜，所以難以比較。但為了得到既簡(jiǎn)單又具有足夠信息以計(jì)算不同菌株之間遺傳距離的電泳圖譜，人們將PCR技術(shù)與RFLP分析結(jié)合在一起，即利用PCR技術(shù)擴(kuò)增普遍存在于細(xì)菌中的激進(jìn)基因區(qū)域，再用特異的限制性內(nèi)切酶對(duì)得到特殊基因片段進(jìn)行酶切、電泳和圖譜分析(PCR-RFLP分析)用于這一目的特殊基因主要是核糖體RNA 基因，即16SrDNA 23SrDNA 和16SrDNA 23SrDNA 基因的間隔區(qū)序列，此外根瘤菌的結(jié)瘤基因和固氮基因等也曾用于PCR-RFLP。