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Southern雜交對于高分子量的DNA的作用
閱讀：135 發(fā)布時間：2023-7-13Southern雜交對于高分子量的DNA 如高等生物的細(xì)胞核DNA 酶切后很難用電泳分開。單純用酶切圖譜很難說清，往往染出連續(xù)一片。另外對于酶切后大小相似的片段其核酸序列是否相似。Southern發(fā)明膜上原位DNA 雜交后，使多態(tài)性分析更為精確和完善，因此進行RFLP分析研究時，現(xiàn)在都需要進行Southern雜交。典型的方法是DNA 酶切產(chǎn)物用瓊脂糖電泳分離后，把膠反過來放在濾紙上，膠的上方放一張同樣大小的硝酸纖維素膜，再鋪濾紙和吸水紙，并加一重物，膠下的濾紙浸在NaCl檸檬酸鈉溶液中，借毛細(xì)管原理，溶液不時通過膠進入上面的吸水紙層，DNA 隨溶液從原位轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，這就是毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法。另外還可通過電轉(zhuǎn)移或真空轉(zhuǎn)移法將DNA 片段轉(zhuǎn)移至纖維素膜上。轉(zhuǎn)移好的硝酸纖維素膜經(jīng)80℃烘烤2小時，將DNA 片段固定于膜上，用放射性同位素標(biāo)志的探針與膜一起保溫，復(fù)性條件下，凡與探針同源的膜上固定的DNA 就能結(jié)合上探針，洗去沒有結(jié)合的探針，放射自顯影就顯示出與探針同源的DNA 片段。簡單地講其過程包括 ⑴ DNA 純化和酶切；⑵ 酶切片段 電泳分離和轉(zhuǎn)移；⑶ 標(biāo)志雜交探針；⑷ 膜上DNA 雜交；⑸ 同源片段的顯示。
現(xiàn)在許多實驗室在轉(zhuǎn)移時使用尼龍膜。不易碎，據(jù)稱這種膜機械性能好。可以反復(fù)使用，即用一個探針雜交顯示RFLP后，可以洗去探針，用另一個探針和膜上的DNA 再雜交，如此重復(fù)3-5次，得到數(shù)個RFLP另外尼龍膜上的DNA 固定可以用120℃半小時或紫外線照射幾分鐘，節(jié)省了時間，還可以在堿性條件下直接轉(zhuǎn)移DNA
導(dǎo)致酶切片段大小發(fā)生了變化，這種變化可以通過特定探針雜交進行檢測，從而可比較不同品種（個體）DNA 水平的差異（即多態(tài)性）多個探針的比較可以確立生物的進化和分類關(guān)系。所用的探針為來源于同種或不同種基因組DNA 克隆，位于染色體的不同位點，從而可以作為一種分子標(biāo)記(Mark構(gòu)建分子圖譜。限制性片段長度多態(tài)性（RFLPRestrictFragmentLengthPolymorphRFLP技術(shù)于1980年由人類遺傳學(xué)家Bostein提出。第一代DNA 分子標(biāo)志技術(shù)。DoniKel利用此技術(shù)于1987年構(gòu)建成第一張人的遺傳圖譜。DNA 分子水平上的多態(tài)性檢測技術(shù)是進行基因組研究的基礎(chǔ)。RFLPRestrictFragmentLengthPolymorphism,或酶切位點之間發(fā)生了堿基的插入、缺失。限制片段長度多態(tài)性)已被廣泛用于基因組遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位以及生物進化和分類的研究。RFLP根據(jù)不同品種（個體）基因組的限制性內(nèi)切酶的酶切位點堿基發(fā)生突變。
即表示目標(biāo)基因與分子標(biāo)志之間的距離，從而可將基因定位于分子圖譜上。分子標(biāo)志克隆在質(zhì)粒上，可以繁殖及保存。不同限制性內(nèi)切酶切割基因組DNA 后，所切的片段類型不一樣，因此，限制性內(nèi)切酶與分子標(biāo)志組成不同組合進行研究。常用的限制性內(nèi)切酶一般是HindⅢ，BamHⅠ,標(biāo)明這個性狀（基因）與分子標(biāo)志連鎖。分子標(biāo)志與性狀之間交換值的大小。當(dāng)某個性狀（基因）與某個（些）分子標(biāo)志協(xié)同分離時。EcoRⅠ,EcoRV,XbaⅠ,而分子標(biāo)志則有幾個甚至上千個。分子標(biāo)志越多，則所構(gòu)建的圖譜就越飽和。構(gòu)建飽和圖譜是RFLP研究的主要目標(biāo)之一。
RFLP分析是集限制性內(nèi)切酶、核酸電泳、印跡技術(shù)、探針雜交等技術(shù)于一體的綜合應(yīng)用。其原理如下：每一限制性核酸內(nèi)切酶在切割DNA 分子時都有固定的切點序列，多用于臨床遺傳性疾病的基因診斷。DNA 分子中核苷酸排列順序的變化有可能使該切點丟失或增加。由于不同生物群體的DNA 序列千差萬別，因而用同一限制性內(nèi)切酶消化后，所得DNA 片段的長度分布也是千變?nèi)f化的這種酶切片段長度分布的多樣性就稱為限制性片段長度多態(tài)性(RestrictFragmentLengthPolymorphRFLP其常用于生物群體的遺傳分析。
然后在瓊脂糖凝膠上電泳分離后對所得圖譜進行分析比較得出分類結(jié)論，以顯示不同種群基因組DNA 限制性片段長度多態(tài)性。RFLP發(fā)生的指紋圖譜更適用于細(xì)菌種間及種內(nèi)株間的分型鑒定。RFLP可以對大量的DNA 樣品進行有效的分析，同時，對mtDNA 線粒體DNA 分折對種內(nèi)或種問的分類會更靈敏。此外，核糖體rRNA 分析也已應(yīng)用于真菌種間和種下的親緣關(guān)系。限制性片段長度多態(tài)性(restrictiongfragmentlengthpolymorphism,最初用于有性繁殖后代的分離以構(gòu)建遺傳圖(Botsteiet1980也是第一代以DNA 指紋圖譜為基礎(chǔ)用于環(huán)境微生物分型鑒定的方法。其原理是利用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶在特定位點上將細(xì)胞基因組DNA 切割成不同長度的片段。RFLP分析。