克隆化一般是指將抗體陽性孔進(jìn)行克隆化。犚r為經(jīng)過HAT篩選后的雜交瘤克隆不能保證一個(gè)孔內(nèi)只有一個(gè)克隆。在實(shí)際工作中，可能會(huì)有數(shù)個(gè)甚至更多的克隆，可能包括抗體分泌細(xì)胞、抗體非分泌細(xì)胞；所需要的抗體(特異性抗體)分泌細(xì)胞和其它無關(guān)抗體分泌細(xì)胞。要想將這些細(xì)胞彼此分開，就需要克隆化?？寺』脑瓌t是，對(duì)于檢測抗體陽性的雜交克隆應(yīng)盡早進(jìn)行克隆化，否則抗體分泌的細(xì)胞會(huì)被抗體非分泌的細(xì)胞所抑制，因?yàn)榭贵w非分泌細(xì)胞的生長速度比抗體分泌的細(xì)胞生長速度快，二者競爭的結(jié)果會(huì)使抗體分泌的細(xì)胞丟失。即使克隆化過的雜交瘤細(xì)胞也需要定期的再克隆，以防止雜交瘤細(xì)胞的突變或染色體丟失，從而喪失產(chǎn)生抗體的能力。
(一) 克隆化方案
用克隆化的方法很多，而zui常用就是有限稀釋和軟瓊脂平板法。
1. 有限稀釋法的程序
① 制備飼養(yǎng)細(xì)胞懸液(同融合前準(zhǔn)備)
② 陽性孔細(xì)胞的計(jì)數(shù)，并調(diào)細(xì)胞數(shù)在1～5×10３／ml
③ 取130個(gè)細(xì)胞放入6.5ml含飼養(yǎng)細(xì)胞*培養(yǎng)液，即20個(gè)細(xì)胞／ml，100μl／孔加A、B、C三排為每孔2個(gè)細(xì)胞。余下2.9ml細(xì)胞懸液補(bǔ)加2.9ml含飼養(yǎng)細(xì)胞的*培養(yǎng)液,細(xì)胞數(shù)為10個(gè)／ml，100μl／孔加D、E、F三排，為每孔1個(gè)細(xì)胞。余下2.2ml細(xì)胞懸液補(bǔ)加2.2ml含飼養(yǎng)細(xì)胞的*培養(yǎng)液，細(xì)胞數(shù)5個(gè)／ml，100μl／孔，加G、H兩排，為每孔0.5個(gè)細(xì)胞。
④ 培養(yǎng)4～5天后，在倒置顯微鏡上可見到小的細(xì)胞克隆，補(bǔ)加*培養(yǎng)液200μl／孔。
⑤ 第8～9天時(shí)，肉眼可見細(xì)胞克隆，及時(shí)進(jìn)行抗體檢測。
注:初次克隆化的雜交瘤細(xì)胞需要在*培養(yǎng)液中加HT。 elisa試劑盒
2. 軟瓊脂法
① 軟瓊脂的配制
含20％FCS(小牛血清)的2倍濃縮的RPMI1640
1％瓊脂水溶液：高壓滅菌，42℃預(yù)熱。
0.5％瓊脂：由1份1％瓊脂加1份含20％小牛血清的2倍濃縮的RPMI1640配制而成。置42℃保溫。
② 用上述0.5％瓊脂液(含有飼養(yǎng)細(xì)胞)15ml傾注于直徑為9cm的平皿中，在室溫中待凝固后作為基底層備用。
③ 按100／ml，500／ml或5000／ml等濃度配制需克隆的細(xì)胞懸液。
④ 1ml 0.5％瓊脂液(42℃預(yù)熱)在室溫中分別與1ml不同濃度的細(xì)胞懸液相混合。
⑤ 混勻后立即傾注于瓊脂基底層上，在室溫中10分鐘，使其凝固，孵育于37℃，5％CO2孵箱中。
⑥ 4～5天后即可見針尖大小白色克隆，7～10天后，直接移種至含飼養(yǎng)細(xì)胞的24孔板中進(jìn)行培養(yǎng)。
⑦ 檢測抗體，擴(kuò)大培養(yǎng)，必要時(shí)再克隆化。
(二) 雜交瘤細(xì)胞的凍存
及時(shí)凍存原始孔的雜交瘤細(xì)胞、每次克隆化得到的亞克隆細(xì)胞是十分重要的。因?yàn)樵跊]有建立一個(gè)穩(wěn)定分泌抗體的細(xì)胞系的時(shí)候，細(xì)胞的培養(yǎng)過程中隨時(shí)可能發(fā)生細(xì)胞的污染、分泌抗體能力的喪失等等。如果沒有原始細(xì)胞的凍存，則因?yàn)樯鲜龅囊馔舛ΡM棄。
雜交瘤細(xì)胞的凍存方法同其他細(xì)胞系的凍存方法一樣，原則上細(xì)胞應(yīng)在每支安瓿含1×106以上，但對(duì)原始孔的雜交瘤細(xì)胞可以因培養(yǎng)環(huán)境不同而改變，在24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，當(dāng)長滿孔底時(shí)，一孔就可以凍一支安瓿。
細(xì)胞凍存液:
50％小牛血清 elisa試劑盒
40％不*培養(yǎng)液
10％ DMSO(二甲亞砜)
凍存液預(yù)冷，操作動(dòng)作輕柔、迅速。凍存時(shí)從室溫可立即降到0℃，再降溫時(shí)一般按每分鐘降溫2～3℃，待降至-70℃可放入液氮中。或細(xì)胞管降至0℃ 后放-70℃超低溫冰箱，次日轉(zhuǎn)入液氮中。也可以用細(xì)胞凍存裝置進(jìn)行凍存。凍存細(xì)胞要定期復(fù)蘇，檢查細(xì)胞的活性和分泌抗體的穩(wěn)定性，在液氮中細(xì)胞可保存數(shù)年或更長時(shí)間。 elisa試劑盒
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