在ELISA檢測試劑盒中應用的抗體可分為多克隆抗體（多抗）和單克隆抗體（單抗）。多抗取白免疫動物的抗血清，制備較簡單，但抗血清成分復雜，除含針對抗原（多個表位）的抗體外，還含有多種其他抗體，親和力和特異性相對要低于單抗，且制備周期長，批間差異較大。而單抗僅針對抗體的單一表位，親和力和特異性均較多抗高，且制備技術成熟，產量大，批間差異小，但結合位點的單一也正是其弱點之所在，在雙抗體夾心法中，如包被和指示抗體使用同一單抗，則由于結合位點的缺乏，容易造成假陰．性結果。
在使用雙單抗一步法時，ELISA檢測試劑盒應注意抗原過剩時的“鉤狀效應"上式中DH2為供氫體（即底物），H2O2為受氫體。HRP對受氫體的專一性很高，除H2O2外，僅作用于小分子醇和尿素的過氧化物。HRP的底物有多種，在ELISA中常用的有：鄰苯二胺（orthophenylenediamine，OPD），四甲基聯(lián)苯胺（3，3，5，5- tetramethyl-benzidine，TMB）和2，2，-連氮基-雙-3-乙基苯噻唑啉磺酸鹽[2，2，-azino-bisc（3- ethyl-benzthiazolinesulfonate-6），ABTS]。三者各有優(yōu)缺點：OPD是在ELISA中應用zui多的底物，靈敏度高，比色方便，但配成溶液后穩(wěn)定性差，且有致異變性；TMB經酶作用后由五色變藍色，加酸終止反應后顯黃色，目測對比鮮明，可比色定量，溶液的穩(wěn)定性也較差，但無致異變性，因此應用日見增多；ABTS雖然靈敏度不如OPD和TMB，但空白值很低。
在ELISA檢測試劑盒中酶作用于底物后生成有色物質、熒光物質或導致化學發(fā)光，分別可用分光光度計、熒光光度計測量及照度計測量。熒光和化學發(fā)光測定的敏感度均高于比色測定，標準曲線的線性范圍亦較比色反應寬，測定效果優(yōu)于常用的比色ELISA檢測試劑盒。
（2）ALP：是一種磷酸酯的水解酶，用做示蹤酶的ALP活性應在l 000U／mg以上。ALP常用的底物為對硝基苯磷酸鹽（PNP），降解產物為黃色的對硝基酚。經NaOH終止酶反應后，ELISA檢測試劑盒顏色維持比較穩(wěn)定。
