利用本實(shí)驗(yàn)室融合的抗AFB1雜交瘤細(xì)胞株，通過4次克隆成功篩選出3株穩(wěn)定分泌抗AFB1單克隆抗體的細(xì)胞株。采用間接ELISA方法對3株細(xì)胞株進(jìn)行亞類和特異性鑒定，選擇10D12細(xì)胞株進(jìn)行單克隆抗體的大量制備。辛酸飽和硫酸銨法結(jié)合HiTrap Protein G HP親和柱純化后的單克隆抗體亞類主要為IgG1，親和常數(shù)為2.85×1010L/mol，屬于高親和力抗體。SDS-PAGE電泳結(jié)果表明純化后的單克隆抗體純度較高，無雜蛋白。間接ELISA方法測定濃度為0.5mg/mL的純化單克隆抗體的效價為1：16000，滿足本試驗(yàn)的要求。采用魯米諾-對碘*-過氧化氫增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光體系進(jìn)行*B1間接競爭化學(xué)發(fā)光酶免疫分析方法的建立。魯米諾、對碘*、過氧化氫濃度均為1mM時的檢測效果。
通過對影響反應(yīng)靈敏度的各參數(shù)的優(yōu)化，成功建立了AFB1間接競爭化學(xué)發(fā)光酶免疫分析方法。所建方法的直線回歸方程為Logit（Y）=1.5602-4.1389log（X），IC50為2.4314μg/L，檢出限為0.09μg/L，擬合曲線的線性范圍為0.31μg/L20μg/L。與進(jìn)口ELISA試劑盒的檢測結(jié)果具有較好的相關(guān)性，表明所建方法可成功用于實(shí)際樣品的檢測。使用相同抗原和抗體建立的*B1間接競爭ELISA方法的檢測限為0.56μg/L，線性范圍為0.6310μg/L。所建ELISA方法與AFG1的交叉反應(yīng)率為14.765%，與其它參試毒素的交叉反應(yīng)率均小于3%，表明具有較好的特異性。所建立的間接競爭化學(xué)發(fā)光酶免疫分析方法與間接競爭ELISA方法相比，靈敏度提高了6倍，同時線性范圍也寬于ELISA方法。初步組裝的化學(xué)發(fā)光酶免疫分析試劑盒和ELISA試劑盒均可在4度保存3個月以上。
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