人血清、血漿及相關(guān)液體樣本中Ⅰ型前膠原C末端肽(CICP)含量的檢測
實(shí)驗(yàn)試劑
1. 人Ⅰ型前膠原C末端肽(CICP)定量檢測試劑盒(ELISA)
2. 蒸餾水
實(shí)驗(yàn)設(shè)備
1. 37℃恒溫箱
2. 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀
3. 精密移液器及一次性吸頭
4. 一次性試管
5. 吸水紙
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 準(zhǔn)備：從冰箱取出試劑盒，室溫復(fù)溫平衡30分鐘。
2. 配液：用蒸餾水將20倍濃縮洗滌液稀釋成原倍的洗滌液。
3. 加標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣本：取足夠數(shù)量的酶標(biāo)包被板，固定于框架上，分別設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測樣本孔和空白對(duì)照孔，記錄各孔位置，在標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品50μL；待測樣本孔中先加入待測樣本10μL，再加*40μL(即樣本稀釋5倍)；空白對(duì)照孔不加。
4. 溫育：37℃水浴鍋或恒溫箱溫育30min。
5. 洗板：棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板4次(也可用洗板機(jī)按說明書操作洗板)。
6. 加酶標(biāo)工作液：每孔加入酶標(biāo)工作液50μL，空白對(duì)照孔不加。
7. 溫育：37℃水浴鍋或恒溫箱溫育30min。
8. 洗板：棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板4次(也可用洗板機(jī)按說明書操作洗板)。
9. 顯色：每孔先加入顯色劑A 液50μL，再加入顯色劑B液 50μL，平板混勻器混勻30s(或用手輕輕震蕩混勻30s)，37℃避光顯色15min。
10. 終止：取出酶標(biāo)板，每孔加終止液50μL，終止反應(yīng)(顏色由藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。
11. 測定：以空白孔調(diào)零，在終止后15分鐘內(nèi)，用450nm波長測量各孔的吸光值(OD值)。
12. 計(jì)算：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對(duì)應(yīng)的OD值，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣本的OD值，在回歸方程上計(jì)算出對(duì)應(yīng)的樣品濃度，也可以使用各種應(yīng)用軟件來計(jì)算。zui終濃度為實(shí)際測定濃度乘以稀釋倍數(shù)。
注意事項(xiàng)
1. 樣本不能含疊氮鈉(NaN3)，因?yàn)榀B氮鈉(NaN3)是辣根過氧化物酶(HRP)的抑制劑。
2. 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能立即試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3. 樣本應(yīng)充分離心，不得有溶血及顆粒。
4. 實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照說明書的操作進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)。
5. 酶標(biāo)包被板開封后如未用完，應(yīng)立即裝入密封袋中加干燥劑保存。
6. 建議所有的標(biāo)準(zhǔn)品、樣本和空白對(duì)照都做雙份檢測，取平均值，以減小實(shí)驗(yàn)誤差。
7. 牢記樣本已經(jīng)稀釋5倍，計(jì)算結(jié)果乘以5才是樣本實(shí)際濃度。
8. 本試劑盒定量范圍為3.75-120ng/mL，超過此范圍，為標(biāo)準(zhǔn)曲線延伸計(jì)算所得，不做為準(zhǔn)確定量結(jié)果，請(qǐng)用特殊稀釋液稀釋后測定準(zhǔn)確結(jié)果(3.75-120ng/mL范圍內(nèi))，乘以總稀釋倍數(shù)即為樣本zui終濃度。
9. 若顯色過淺，可適當(dāng)延長底物溫育時(shí)間。
10. 為避免交叉污染，標(biāo)準(zhǔn)品、樣本和空白對(duì)照每加一個(gè)就要更換一次吸頭；酶標(biāo)工作液、*和底物等公共組分，要懸臂加樣，不得碰到微孔；不得重復(fù)使用封板膜。
11. 試劑盒保質(zhì)期內(nèi)使用，不同批號(hào)的試劑不得混用。
12. 底物B對(duì)光敏感，避免長時(shí)間暴露于光下。
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