2b-RAD基因分型樣品的制備
實驗試劑
ALFI（(Fermentas, cat no. ER1801）
T4連接酶（NEB, cat no. M0202）
ATP（NEB, cat no. P0756）
DNA聚合酶（(NEB, cat no. M0530）
dNTP（NEB, cat no. N0447）
瓊脂糖
所有的連接子和寡核苷酸引物購于 IDT。
實驗步驟
1. 酶切
1) 準備完整，高質(zhì)量的基因組DNA樣本，每個樣本含量為1µg，在高濃度(至少250 ng µl-1)。用無核酸水稀釋所有樣品至相同體積(4μL)。
2) 通過將以下物質(zhì)加入一個試管中混合，獲得酶切混合物。這里所指體積為單一一個反應的體積，因此乘以樣本數(shù)，再多加上一些避免吸取導致的誤差。
0.6μL 10×緩沖R
0.4μL 150μM的SAM
1.0 U AlfI
加入無核酸水(NFW)至總體積2.0 µl
3) 將 2μL酶切混合物與 4μL DNA樣品混合，并在37°C孵育1小時，然后在65℃滅活酶20分鐘，保持樣本在冰上。
2. 接頭連接
1) 準備2份雙鏈接頭，都用終濃度為4μM的寡核苷酸綁定，通過SLD- ada1-ALFI和反SLD- ada1連接準備接頭1，通過SLD- ada 2 AlfI和反SLD- ada2相連接準備接頭2。
2) 將下列物質(zhì)混合在一個試管中來制備連接混合物，這里列出的體積為單一一個的反應體積，因此根據(jù)需要擴充體積。
0.5μL 10 mM ATP
2.0μL 10× T4連接酶緩沖液
2.5μL 5μM的接頭1
2.5μL 5μM 的接頭2
11.5μL NFW
3) 將5μL消化的DNA與20μL酶切混合物混合。孵育1小時(熱滅活酶，16°C如ALFI，或未滅活酶，4°Ç，如BsaXI)，放置冰上。
條形碼插入
1預試PCR確定zui低循環(huán)數(shù)，并評估樣品的相對產(chǎn)量。通過以下成分混合在一個試管內(nèi)準備一份PCR酶切混合物。這里列出的體積為單一一個的反應體積，因此根據(jù)需要擴充體積。
6.5μL NFW
2.5μL 2.5 mM dNTP
0.4μL 10μM SLD-P5
0.4μL 10μM SLD-P6
1.0μL 1μM SLD-P3
1.0μL 1μM SLD-P4 (條碼碼)
4.0μL 5× HF緩沖區(qū)
0.2μ 聚合酶
2) 每個樣本將16μL酶切混合物與4μL接頭子混合，應用以下程序：(98℃ 5秒，60℃ 20秒，72℃10秒) × 12個循環(huán)。
3) 每個反應5μL樣品，兩個循環(huán)時間間隔(N = 6，8，10，及12個循環(huán))。每個采樣間隔期間，可以暫停熱循環(huán)。
4) 凝膠電泳(2％瓊脂糖TBE緩沖凝膠)檢測PCR 產(chǎn)物，使用小分子量的 marker。要求PCR產(chǎn)物大小?130 bp，選擇循環(huán)的zui低數(shù)。
5) 通過將以下成分混合來準備PCR反應的酶切混合物。這里列出的體積為單一一個的反應體積，因此根據(jù)需要擴充體積。
32.5μL NFW
12.5μL 2.5μM dNTP
2.0μL 10μM SLD-P5
2.0μL 10μM SLD-P6
5.0μL 1μMSLD-P3
5.0μL 1μMSLD-P4(條形碼)
20.0μL 5×HF緩沖液
1.0μ 聚合酶
6) 將80μL酶切混合物與20μL接頭子混合，并根據(jù)第4步確定使用循環(huán)次數(shù)擴增。
凝膠純化
1) 2％??瓊脂糖凝膠，使用標準的電泳方法和標記物。
2) 設置紫外透射為低強度，觀察目標條帶(?130 BP)，限制每個樣品的紫外照射不超過30秒。
3) 從凝膠中切下所得條帶，準備提?。?/p>
a. 根據(jù)你所選擇的膠提取試劑盒，根據(jù)說明提取
b. 將膠直接放入水中洗脫(1.5 ml離心管中40μL NFW)，在4°C過夜，到第二天早上收集洗脫液。
4) 從每個準備液和混合液中收集小片段(2-10µl)，然后測序。剩下的準備液可以20°C保存6個月。
