重組質(zhì)粒的鑒定方法
重組DNA轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞后，須在不同水平上進(jìn)行篩選，以區(qū)別轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子、重組子與非重組子以及鑒定所需的特異性重組子。在轉(zhuǎn)化過程中，并非每個(gè)受體細(xì)胞都被轉(zhuǎn)化；即使獲得轉(zhuǎn)化細(xì)胞，也并非都含有目的基因，所以需采用有效方法進(jìn)行篩選。篩選的方法包括根據(jù)遺傳表型篩選、限制性內(nèi)切酶分析篩選、核酸探針篩選、PCR篩選等。本實(shí)驗(yàn)采用遺傳表型篩選中的抗生素平板篩選或α互補(bǔ)篩選的方法。
一、抗生素平板篩選
【實(shí)驗(yàn)原理】
目標(biāo)基因是Kan的抗性基因，而載體含Amp 的抗性基因，因此在含有Amp 和Kan的培養(yǎng)基中生長的菌落即為陽性菌落。
【操作步驟】
1．制備含有Amp 和 Kan 的LB瓊脂培養(yǎng)板
2．將100μl 轉(zhuǎn)化菌液用無菌涂布器均勻涂布于含有Amp 和Kan培養(yǎng)板上，37℃培養(yǎng)12-16h 。
3．在含有Amp和Kan培養(yǎng)板上能生長的菌落即為陽性重組質(zhì)粒。并將其接種于含Kan的LB液體培養(yǎng)基2ml中培養(yǎng)8-16h。
4．小量制備質(zhì)粒，限制性酶切分析進(jìn)一步鑒定。
二、α互補(bǔ)篩選
【實(shí)驗(yàn)原理】
適用于含有半乳糖苷酶基因（LacZ）的載體，如 pUC系列等，其原理是：載體含有LacZ的調(diào)控序列和N端146個(gè)氨基酸的編碼信息。在這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)。當(dāng)這種載體進(jìn)入可編碼β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細(xì)胞后（質(zhì)粒和宿主細(xì)胞編碼的片段各自都沒有酶活性），它們可以融為一體，形成具有酶學(xué)活性的蛋白質(zhì)，這種現(xiàn)象叫α互補(bǔ)。由α互補(bǔ)而產(chǎn)生的 Lac+ 細(xì)菌在呈色底物 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷（X-gal）和誘導(dǎo)劑異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）存在下形成藍(lán)色菌落。當(dāng)外源DNA插入到質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)后，導(dǎo)致產(chǎn)生無α互補(bǔ)能力的氨基端片段。因此，帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。通過呈色反應(yīng)即可初步識(shí)別可能帶有重組質(zhì)粒的菌落。通過小量制備質(zhì)粒DNA進(jìn)行限制酶切分析，即可確定這些質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)。
【試劑】
1．X-gal（20mg／m l）：將20mg X-gal溶于l ml二甲基甲酰胺中，-20℃避光保存。
2．IPTG（200mg／ml）：將1g IPTG溶于4 ml去離子雙蒸水中，定容至5 ml，用0.22μm過濾器除菌，-20℃保存?zhèn)溆谩?nbsp;
【操作步驟】
1．制備含相應(yīng)抗生素的瓊脂平板。
2．于平板表面加 X-gal 40μl 和IPTG 4μl，并用無菌玻璃涂布器將試劑均勻涂布于整個(gè)平板表面。37℃靜置l h。
3．
將100μl 轉(zhuǎn)化的菌液涂布于平板表面，置37℃培養(yǎng)箱20 min后，倒置平板繼續(xù)培養(yǎng)12～16h。
4．中止培養(yǎng)后，將平板靜置4℃ 4h，使藍(lán)色充分顯現(xiàn)，平皿上顯示藍(lán)色和白色兩種菌落。
5．挑取白色菌落置2 ml LB（含相應(yīng)抗生素）液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)8～12h。
6．提取質(zhì)粒，以限制性酶切分析進(jìn)一步鑒定。
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