大鼠主動脈血管平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng)及鑒定的經(jīng)驗
1.取200g左右的大鼠，其實大鼠的大小要求不高，大點的操作更方便點，也一樣可以出來細(xì)胞。
2.麻醉大鼠，直接麻死也沒事，消毒，剪開腹部皮膚。
3.剪去大鼠左側(cè)的肋骨可見大鼠的肺，如圖所示，把肺翻起，即可見到主動脈，然后把主動脈分離下來，盡量不要有幅度的牽拉。
4.分離下來的血管放入盛有冰的DMEM的培養(yǎng)皿中。
5.培養(yǎng)皿下面一直用冰板墊著，冷的可能保持血管細(xì)胞的活性。
6.在體式顯微鏡下分離血管中膜。
先用一把*子和一把直鑷，直鑷固定血管，*夾去血管外的血凝塊和脂肪組織。然后用*把*開，用兩把眼科彎鑷，輕輕的刮一下血管內(nèi)膜，把內(nèi)皮細(xì)胞除去。接下來的是重點，也就是要刮取血管中膜。血管中膜是壓，推，把中膜弄下里，千萬不要用鑷子去撕，撕起來既容易牽拉中膜，又容易破，撕得不完整。如上圖，用一個彎鑷子壓住血管，另一個彎鑷子也加壓壓住血管，然后往下推，這樣中膜由于受力就會出現(xiàn)破口，并與外膜分離開來。中膜與外膜的形態(tài)區(qū)別很容易辨認(rèn)，中膜刮下來之后還是挺拔的保持著血管的形態(tài)，而外膜就是軟軟的一灘。
7.把中膜移到培養(yǎng)皿的蓋子上面，沾點DMEM上去，這樣更容易剪碎。
8.在培養(yǎng)皿上把中膜剪碎，剪個一百兩百下，剪刀要鋒利一點，然后用滴管移到培養(yǎng)瓶中。
9.倒置的培養(yǎng)瓶中加入20%胎牛血清的DMEM液，放入培養(yǎng)箱，大概2個小時等組織塊黏在培養(yǎng)瓶上之后翻過來。
10. 大概5天左右換液換一次，一般一周左右開始有零星的細(xì)胞爬出，兩周左右細(xì)胞比較多，三周左右可以傳代。 這里有一點很重要就是千萬不要每天去看，三四天去看一次，每天看長不出來的，我開始也是每天看，一直都長不出來。還有換液也有一點要注意，有一顆一顆的小黑點如圖所示的時候，換液要用PBS洗，加入pbs后用力的搖晃培養(yǎng)瓶，把這些小雜物都晃掉，多洗幾次，放心，不會把組織塊和細(xì)胞也晃起來的，組織塊細(xì)胞貼壁都貼的很牢。
原代細(xì)胞由于是從組織塊中爬出來的，開始形態(tài)各種各樣，三角形梭形原型方形的都有，只要是按上面的方法剝離中膜養(yǎng)出來的，鑒定下來基本都是*純的平滑肌細(xì)胞。以下都是原代細(xì)胞的樣子，不要懷疑是不是，長到第三代的時候基本就是平滑肌細(xì)胞的樣子了。
細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定，就是所謂的hill and velley現(xiàn)象，就是細(xì)胞多的地方疊在一起，形成一個hill山峰，細(xì)胞少的地方一個都沒有，形成一個velley山谷。
下面講平滑肌細(xì)胞的鑒定，我用的是熒光免疫的方法，
1.96孔板中，每孔加入大約3000-5000個細(xì)胞，長幾天看細(xì)胞形態(tài)比較好的時候開始做
2pbs洗三遍，每遍5分鐘
3 4%甲醛固定，15分鐘 pbs洗兩遍
4 穿透用0.25% TritonX-100 10分鐘pbs洗兩遍
5 血清封閉半小時
6加1抗 4度過夜
7 PBST洗兩遍 加2抗兩小時
8 pbst洗兩遍 加DAPI 繼續(xù)用pbs洗兩遍
