實時熒光定量PCR實驗體系的設(shè)計與優(yōu)化
時熒光定量PCR以其、快速、方便，越來越多的應(yīng)用在科研、臨床及檢驗檢疫的各個領(lǐng)域。但是定量PCR是對性要求很高的實驗，不僅要求在實驗前有比較完整的實驗設(shè)計方案，而且實驗的條件對實驗結(jié)果的影響也非常大。這些都是很多老師與學(xué)生非常關(guān)心的問題，下面分別從這兩個方面來對定量PCR實驗做一些闡述。
定量PCR實驗步驟（以mRNA為例）：
1.設(shè)計實驗方案：例如對樣品、實驗組和對照組的一個實驗流程設(shè)計
2.引物和探針的設(shè)計和合成
3.抽提RNA，測定提取的RNA的濃度
4.反轉(zhuǎn)錄PCR
5.定量PCR
6.數(shù)據(jù)分析
在進(jìn)行定量PCR實驗的過程中，PCR的擴增效率是一個非常重要的影響因素，因為定量PCR原理的理論方程是基于擴增效率zui大值1，因此高的擴增效率能保證定量PCR實驗的性及重復(fù)性，影響PCR擴增效率主要有以下幾個方面：1，擴增子的長度；2，擴增子的GC含量；3，擴增子、引物和探針的二級結(jié)構(gòu)；4，PCR反應(yīng)各組分的濃度；5，RNA或者cDNA的純度。
進(jìn)行定量PCR實驗時，必須設(shè)計好引物和探針，除了能獲得高的擴增效率外，對PCR擴增的特異性、消除DNA的擴增及提高擴增的靈敏度都有很大的影響。下圖就是使用不同的引物和探針對18SRNA進(jìn)行定量PCR的熒光曲線圖（反應(yīng)條件和模板都相同）。
引物設(shè)計原則：
1.上下游引物要保守為了能夠擴增出所需要的保守片段，必須對保守的100-200片段進(jìn)行PCR擴增。所以引物的選取也要非常的保守。
2.上下游引物的長度一般為18-30bp之間，且Tm值在58-62℃之間，上下游引物的Tm值相差不超過2℃。
3.確保引物中GC含量在30-80%。應(yīng)避免引物中多個重復(fù)的堿基出現(xiàn)，尤其是要避免4個或超過4個的G堿基出現(xiàn)。引物的3’端不為G或/和C。引物3’端的5個堿基不應(yīng)出現(xiàn)2個G或/和C。
4.避免引物內(nèi)出現(xiàn)反向重復(fù)序列形成發(fā)夾二級結(jié)構(gòu)，同時也應(yīng)避免引物間配對形成引物二聚體。5．跨外顯子設(shè)計引物，用于區(qū)別或消除DNA的擴增。
探針設(shè)計的基本原則：
1. 保守：探針要的保守，有時分型就僅僅依靠探針來決定。理論上有一個堿基不配對，就可能檢測不出來。
2. Taqman探針的長度在25-32bp之間，且Tm值在68-72℃之間，確保探針的Tm值要比引物的Tm值高出5-10℃，這樣可保證探針在退火時先于引物與目的片段結(jié)合。
3. 確保探針中GC含量在30-80%。
4. 避免探針中多個重復(fù)的堿基出現(xiàn)，尤其是要避免4個或超過4個的G堿基
5. 探針的5’端不能為G，因為即使單個G堿基與FAM熒光報告基團相連時， 也可以淬滅FAM基團所發(fā)出的熒光信號，從而導(dǎo)致假陰性的出現(xiàn)。
6. Taqman探針應(yīng)靠近上游引物，即Taqman探針應(yīng)靠近與其在同一條鏈上的 上游引物。兩者的距離是探針的5’端離上游引物的3’有一個堿基。
7. 避免探針與引物之間形成二級結(jié)構(gòu)。
8. 對于多重定量PCR，例如SNP分型檢測時，SNP位點應(yīng)設(shè)計在探針的中間位置，并且兩種探針的Tm值應(yīng)相近。
實時定量PCR體系的優(yōu)化
1.基本參數(shù)的優(yōu)化：
1）MgCl2的濃度：在PCR反應(yīng)中，MgCl2的濃度對酶的活性是至關(guān)重要的，不僅如此，合適的MgCl2的濃度還能在反應(yīng)中得到較低的Cp(crossingpoint)值（指PCR達(dá)到指數(shù)擴增期時，產(chǎn)生一定的熒光高于背景并為儀器所識別時的循環(huán)數(shù)），較高的熒光信號強度以及良好的曲線峰值。所以對其的濃度選擇應(yīng)慎重。一般來說，對以DNA或cDNA為模板的PCR反應(yīng)，應(yīng)選擇2－5mM濃度的MgCl2，對以mRNA為模板的RT－PCR而言，則應(yīng)選擇的濃度為4－8mM。
2）模板的濃度：如果研究者是進(jìn)行實驗，那么應(yīng)選擇一系列稀釋濃度的模板來進(jìn)行實驗，以選擇出zui為合適的模板濃度，如果條件困難，也至少要選擇兩個稀釋度（高和中、低濃度）來進(jìn)行實驗。一般而言，使Cp位于15－30個循環(huán)比較合適，若大于30則應(yīng)使用較高的模板濃度，如果Cp小于15則應(yīng)選擇較低的模板深度。對于Cp值的確定，經(jīng)驗上是SYBRGreenI探針的熒光信號比本底高2倍，雜交探針的熒光強度比本底高0.3倍。
2.使用SYBRGreenI測定DNA時的條件優(yōu)化：
1）MgCl2的濃度：大多數(shù)引物－模板對其的要求是2－4mM。
2）模板的濃度：初次實驗要求做一系列的稀釋濃度，如條件限制，至少完成兩個稀釋的度的測定。DNA在50ng-5pg之間選擇，質(zhì)粒DNA在106拷貝數(shù)左右。
3）引物的濃度：引物的濃度是一個影響PCR反應(yīng)的關(guān)鍵因素，若濃度太低，會致使反應(yīng)不*，若引物太多，則發(fā)生錯配以及產(chǎn)生非特異的產(chǎn)物的可能性會大大增加。對于大多數(shù)PCR反應(yīng)，0.3uM是個合適的濃度，若初次選用這個濃度不理想，可在0.1－1.0uM之間進(jìn)行選擇，直至達(dá)到滿意的結(jié)果。
4）退火溫度：實驗設(shè)置的退火溫度應(yīng)比計算得出的Tm值小5℃，然后在1－2℃內(nèi)進(jìn)行選擇。一般的，退火溫度要根據(jù)經(jīng)驗來確定，這個經(jīng)驗值往往會同計算得到的Tm值有一定的差距。
3.用SYBRGreenI進(jìn)行一步法RT－PCR的條件優(yōu)化：
1）MgCl2的濃度：不同的靶分子選用不同的濃度，通常是在4－8mM之間選擇。
2）模板的濃度：RT－PCR實驗既可以選用總RNA，又可以選用mRNA，其濃度應(yīng)在1pg-1ug之間選擇。對于低模板濃度，可以增加適量的MS2或用alternativeRNA作為載體進(jìn)行測定。
3）對照設(shè)置：每一引物都應(yīng)設(shè)有陰性對照，陽性對照和污染對照。
4.雜交探針測定DNA
1）MgCl2的濃度：在2－4mM的基礎(chǔ)上加0.5－1.0mM，但是不要超過2.0mM。
2）雜交探針的濃度：初次實驗每個探針用0.2uM，如果信號強度達(dá)不到要求，可以增加至0.4uM。
3）對照設(shè)置：每一引物都要設(shè)陰性對照，每一探針都要設(shè)陰性對照。每次實驗都要設(shè)陽性對照。
4）其它的條件同SYBRGreenI。
5.用雜交探針進(jìn)行實時定量RT－PCR：
1）MgCl2的濃度：在4－8mM之間進(jìn)行選擇。
2）雜交探針的濃度：初實驗用0.2uM，如果熒光信號強度不足，可以增加至0.4uM。
3）模板濃度設(shè)置：優(yōu)化的擴增須進(jìn)行一系列稀釋度的實驗，在條件有困難的情況下，至少要進(jìn)行兩個稀釋度的測定。選用1pg-1ug的總RNA或是mRNA，若是模板的濃度過小（小于10ng/ul），則可加入MS2或alternativeRNA作為載體。
4）對照設(shè)置：每個引物都要設(shè)無模板對照，陽性對照以及污染對照。
6.關(guān)于雜交探針的評價：在使用雜交探針進(jìn)行實驗時，必須注意防止探針－引物二聚體的形成和其本身在反應(yīng)過程中的延伸。引物－探針二聚體的形成，主要是因為探針可與引物的3’末端雜交，其形成以后，會致使此二聚體擴增，從而同目的基因競爭反應(yīng)的原料，導(dǎo)致反應(yīng)的效率下降。探針其本身能同目的基因相結(jié)合，且其解鏈溫度高于引物，所以它可能作為引物而引發(fā)延伸反應(yīng)，為了防止發(fā)生這種現(xiàn)象，通常是將其3’末端*磷酸化，使之不能延伸，若此磷酸化不*或是沒有磷酸化，就會產(chǎn)生目的基因的副產(chǎn)品，從而干擾實驗結(jié)果。鑒于以上這兩點，所以應(yīng)對探針精心設(shè)計，并將其末端*磷酸化。
