緩沖液配方的常見問題
閱讀：555發(fā)布時間：2016-11-3
緩沖液配方的常見問題
UU.轉膜后的脫脂奶粉封閉時，所用的防沫劑A是什么？還有Tris-HCl是不是就是用Tris和鹽酸配出來的呢？
解答：轉膜后的脫脂奶粉封閉液是5%的TBST脫脂奶粉。Tris－HCl就是Tris鹽用HCl調ph值，配置而成。
VV.準備做大鼠腦的WesternBlot，蛋白質位于細胞核中，請問此蛋白質的提取液及操作方法是？每一步都必須要低溫嗎？這種蛋白質是磷酸化的蛋白質，操作時如何防止去磷酸化的發(fā)生？
解答：可以用提取總蛋白的buffer提核蛋白，可以加NaF防止去磷酸化。
WW.想問一下細胞裂解液選擇蛋白酶抑制劑時有什么原則嗎？受不受組織來源的影響？胞膜和胞漿有區(qū)別嗎？
解答：一般來說提取時加入光譜的蛋白酶抑制劑就可以了，操作時保持低溫。除非有文獻特別指明用特殊的方法，一般來說都沒有區(qū)別。
XX.zui近作了兩次WesternBlot，不但沒陽性結果，顯色背景都沒有，電泳和轉膜都染過，有條帶。底片和顯色液及DAB顯色液均試過，沒問題。1、檢測GAD--分子量67kd，提取液有蔗糖，其余同三去污裂解液。蔗糖不會有影響把？樣本--20度放置一周內測。2、一抗放置2年，可能效價不高！用的是1:100。如果是一抗的原因，不會背景都沒有把？3、*次有不均勻背景，因為一抗過夜時密封袋不均勻。后兩次無背景顯色。4、封閉液用的是含15%脫脂奶粉TBST，漂洗液用的是含1%BSA的TBST液，TWEEN-20為0.1%，不會是封閉液的問題吧？
解答：可以在下面幾個問題上找找原因。1.封閉液用5％Milk，漂洗液（washingbuffer用TBST）2.看看一抗是否能work，降到1：20。3.看看二抗是否有問題。
YY.加甲醇的目的是什么？
解答：加甲醇起著一定的固定作用，因為小分子蛋白質容易轉出去.(特別是在硝酸纖維素膜上，因為NC膜結合蛋白質的能力較弱)。
ZZ.“轉膜后的脫脂奶粉封閉液是5%的TBST脫脂奶粉”，其中TBSTzui后那個T是Tween嗎，濃度多大？
解答：是Tween，配方如下:Tris-BufferedSalineTween-20(TBST),Dissolve8.8gofNaCl，0.2gofKCl，and3gofTrisbasein800mlofdistilledH2O,Add500ulofTween-20,AdjustthepHto7.4withHCl,AdddistilledH2Oto1L,Sterilizebyautoclaving.
AAA.封閉，一抗，二抗時的溫度有沒有什么規(guī)定呢，比如現(xiàn)在我就在室溫里做，或者要在4度下?
解答：均可在室溫進行，如果時間不夠，一抗孵育可以先在室溫進行一個小時，然后4度過夜。
BBB.實驗室暫無NP40我用sds可以嗎？另外有過用尿素和硫脲提取膜蛋白嗎？配方如下：7M尿素，2M硫脲，Triton-x-1000.2ml，新鮮加入：65mMDTT
蛋白酶抑制劑：試劑盒HaltTMProteaseinhibitorcocktailkit1%(v/v)
是用于抽提雙向電泳用蛋白的配方。不止用于抽提細胞全蛋白（主要是想得到其中的膜蛋白）是否可行？
改良的RIPA裂解緩沖液(Tris.HCl，50mmol/L，pH7.5;NaCl，150mmol/L;NP-40，1%;脫氧膽酸鈉，0.5%;SDS，0.1%;EDTA，1mmol/L;PMSF，1mmol/L;Leupeptin，2μg/ml)不知對于膜蛋白效果如何？此外該方中的EDTA，是否用做蛋白酶抑制劑？
解答：做２－Ｄ不推薦使用ＮＰ－４０（因為即使進口的ＮＰ－４０也不純，，其中的雜質會影響質譜結果）。對于動物細胞，其蛋白酶活性較弱（相對于組織和大腸桿菌等），可以不使用cocktail，因為7M尿素＋２Ｍ硫脲＋４％ＣＨＡＰＳ構成的變性環(huán)境已經足以抑制大部分蛋白酶的活性，２Ｍ硫脲＋４％ＣＨＡＰＳ對于抽提膜蛋白有很大的幫助，不過如果您專職做膜蛋白建議采用分級抽提法。此外還可以采用梯度離心法和一些基于去垢劑的方法。ＥＤＴＡ用于滅活金屬蛋白酶（主要是其鏊合作用）。加過多的蛋白酶抑制劑可以導致蛋白質的修飾，做ＷＢ無所謂，做ＭＡＩＬＤＩ時會給正確鑒定帶來麻煩。裂解緩沖液中少了兩性電解質(在2-D裂解緩沖液中，兩性電解質起的作用：提供連續(xù)的PH梯度，從很大程度上增加蛋白質的溶解性;還可以去除一部分核酸)；也不推薦采用SDS，因SDS會與蛋白質結合導致其等電點發(fā)生改變，如果您實在要用，終濃度降到0.1%以下。
CCC.WesternStrippingBuffer的配方
解答：METHOD1
1、strippingbuffer:62.5mmol/lTrisPH6.7；100mmol/lbeta-mercaptoethanol；2%SDS
二次發(fā)光protocol:1.strippingbuffer洗膜：50度水浴30分鐘，搖床上搖10-20分鐘。
2、1*PBST洗：搖床上搖30分鐘。
3、封閉，加一抗，二抗（同*次發(fā)光）
METHOD2
?。?0ml總量）：?-mercaptoethanol342μl；20%SDS5ml；Tris-ClpH6.73.125ml；加ddH2O至50ml。
方法：將用過的膜浸入strippingbuffer中，置50℃水浴箱中30min，間斷振搖。之后用TTBS洗3*5min就好。此時你已經可以按新的轉移好的膜來再次使用了。
該方法的優(yōu)點：省事，省力，省錢，符合慣例。
METHOD3
1、beta-metaptoethanol35ul
2、10%SDS1ml
3、tris(0.5M，pH6.7)625ul
4、dH2O3.34ml
50-55℃，30min。
METHOD4
strippingbuffer應該是可以放置很久的。不過我習慣于現(xiàn)配——畢竟，加了β-mercaptoethanol以后太難聞了，配了就用；而且，有了現(xiàn)成的Tris-HCl緩沖液和SDS的母液，現(xiàn)配還是很方便的。每次用量5ml少了點，我每次用50ml。
METHOD5
0.5MNaCl，0.5MHAc；室溫搖床15min。
METHOD6
將用過的膜泡在1*TBS中室溫振搖過夜，中間可以換液2-3次，然后封閉，加一抗，二抗（同*次發(fā)光），實踐證明方法*可行。
不管用那種方法，洗脫后都要用PBS或TBS再洗幾次。
