L929細(xì)胞的轉(zhuǎn)染技術(shù) ：
L929是小鼠成纖維細(xì)胞瘤細(xì)胞株，經(jīng)常被用來檢測TNF-alpha及TNF-beta。對TNF的處理經(jīng)常會引發(fā)細(xì)胞凋亡及死亡，因此L929細(xì)胞經(jīng)常被用作免疫分析。但是，轉(zhuǎn)染L929細(xì)胞非常難，尤其使用基于脂質(zhì)體技術(shù)的轉(zhuǎn)染試劑，我們使用GenJet VerⅡ及PolyJet轉(zhuǎn)染L929細(xì)胞獲得了75%的轉(zhuǎn)染效率，簡單的實驗步驟如下。
1、轉(zhuǎn)染時確保L929細(xì)胞達(dá)到80%的融合度，細(xì)胞必須健康并且傳代不能超過9代。
2、對于6孔板，用不含血清的DMEM分別稀釋1.0μg，DNA及3.0μl，Genjet VerⅡ或PolyJet轉(zhuǎn)染試劑。將稀釋好的轉(zhuǎn)染試劑加入DNA中，室溫下放置15分鐘以形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物，其它規(guī)格的細(xì)胞培養(yǎng)器皿，可以根據(jù)表面積適當(dāng)調(diào)整DNA含量。
3、將轉(zhuǎn)染復(fù)合物直接加入L929細(xì)胞中；6孔板，L929細(xì)胞的轉(zhuǎn)染技術(shù) 每孔含1.0ml培養(yǎng)基，在血清/抗生素存在下,轉(zhuǎn)染進(jìn)行。
4、轉(zhuǎn)染后的24~48小時，監(jiān)測轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)情況。
Brief procedures for transfecting L929 cell.
L929 is a murine aneuploid fibrosarcoma cell line which isoften used to assay TNF-alpha and TNF-beta. Treatment with TNF initiatesapoptosis and subsequent cell death, therefore L929 cell is often used forimmunological assays. However L929 cell is hard to transfect, especiallyresistant to liposome based transfection method. We have been using GenJet Ver.II and PolyJet to transfect L929 cell and got up to 75% efficiency. The briefprocedures are described below for transfecting L929 cells with GenJet andPolyJet.
1. Grow L929 cell to ~80% confluency at the day of transfection. L929 cell mustbe healthy and less than 9 passages for maximum efficiency.
2. For 6-well plate, dilute 1.0 μgof DNA and 3.0 μl of GenJet Ver.II or PolyJet reagents per well with serum free DMEM respectively. Add dilutedreagent to diluted DNA and let transfection complex formed at RT for 15minutes. For other format of cell culture formats, scale down or up perthe surface area of culture dish.
3. Add transfection complex to L929 cell directly. Transfection is conducted inpresence of serum/antibiotics with transfection volume of 1.0 ml per well of6-well plate.
4. Check transgene expression 24~48 hours post transfection.
選擇GenJetTM，LipoD293TM & PolyJetTMDNA轉(zhuǎn)染試劑稀釋溶液的小技巧：
選擇何種稀釋液稀釋DNA及轉(zhuǎn)染試劑，對于制備有效的轉(zhuǎn)染復(fù)合物至關(guān)重要。除了溫度，孵育時間外，稀釋液的性質(zhì)對于制備的轉(zhuǎn)染復(fù)合物亦非常重要，同樣影響DNA轉(zhuǎn)染效率。根據(jù)我們的實驗數(shù)據(jù)，使用合適的稀釋液得到的轉(zhuǎn)染效率是使用錯誤稀釋液轉(zhuǎn)染效率的至少50倍。更為重要的是，實驗者總是忽視稀釋液的重要性，甚至一直未曾意識到正確的稀釋液對形成有效轉(zhuǎn)染復(fù)合物的重要性。
1、為了制備更有效的轉(zhuǎn)染復(fù)合物，稀釋液中千萬不要含有血清、蛋白。
2、盡量使用接近細(xì)胞培養(yǎng)基成分的稀釋液，例如：若是你使用DMEM（supplemented with serum and antibiotics）培養(yǎng)HEK293細(xì)胞，那么，zui合適的稀釋液是不含血清、抗生素的DMEM：若是您使用RPM1-1640（supplemented with serum andantibiotics）培養(yǎng)Hela細(xì)胞，那么zui合適的稀釋液是不含血清、抗生素的RPM1-1640。
3、請勿使用含有未知成分的培養(yǎng)基。例如，切勿使用Opti-MEMTM稀釋GenJet?、PolyJet?及LipoD293? DNA轉(zhuǎn)染試劑。根據(jù)我們的實驗數(shù)據(jù)，若是使用Opti-MEM稀釋轉(zhuǎn)染試劑及DNA，那么用于HEK293，Hela，CHO及NIH 3T3細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率至少減少50%。Opti-MEMTM可能含有較少的血清，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率的大幅降低。
4、不含血清的高糖DMEM是很好的選擇，可以與其他的生長培養(yǎng)基兼容，如果未能得到較高的轉(zhuǎn)染效率，您可能會考慮更換稀釋液，若是您不明確如何選擇合適的稀釋液，建議您初次可以嘗試不含血清的高糖DMEM，您應(yīng)該會得到滿意的轉(zhuǎn)染效率。
