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ATCC細(xì)胞
SK-MEL-1細(xì)胞 SKLU1細(xì)胞 SKHEP1細(xì)胞 SKBR3細(xì)胞 SiHa細(xì)胞 SH-SY5Y細(xì)胞 SCaBER細(xì)胞 Saos-2細(xì)胞 RPMI 8226細(xì)胞 RL95-2細(xì)胞 RKO細(xì)胞 Reh細(xì)胞 RD細(xì)胞 Ramos細(xì)胞 Raji細(xì)胞 QSG-7701細(xì)胞 QGY-7703細(xì)胞 QGY-7701細(xì)胞 PLC/PRF/5細(xì)胞 PC-3細(xì)胞 PANC-1細(xì)胞 PA-1細(xì)胞 OVCAR-3細(xì)胞 OS-RC-2細(xì)胞 NTERA-2細(xì)胞 NCI-N87細(xì)胞 NCI-H838細(xì)胞 NCI-H661細(xì)胞 NCI-H596細(xì)胞 NCI-H520細(xì)胞 NCI-H460細(xì)胞 NCI-H446細(xì)胞 NCI-H358細(xì)胞 NCI-H295R細(xì)胞 NCI-H292細(xì)胞 NCI-H23細(xì)胞 NCI-H209細(xì)胞 NCI-H2087細(xì)胞 NCI-H1975細(xì)胞 NCI-H1650細(xì)胞 NCI-H1688細(xì)胞 NCI-H157細(xì)胞 NCI-H1395細(xì)胞 NCI-H1299細(xì)胞 KLE細(xì)胞 LNCaP細(xì)胞 LoVo細(xì)胞 LS180細(xì)胞 LS174T細(xì)胞 MCF 10A細(xì)胞 MCF7細(xì)胞 MEG-01細(xì)胞 MG-63細(xì)胞 MRC-5細(xì)胞 NAMALWA細(xì)胞
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PCR 技術(shù) ATCC細(xì)胞

時間:2013/9/9閱讀:1439
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PCR 技術(shù) ATCC細(xì)胞  [實驗?zāi)康腯

通過本實驗學(xué)習(xí)PCR反應(yīng)的基本原理與實驗技術(shù)。
[實驗原理]
多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)的原理類似于DNA的天然復(fù)制過程。在待擴(kuò)增的DNA段兩側(cè)和與其兩側(cè)互補(bǔ)的兩個寡核苷酸引物,經(jīng)變性、退火和延伸若干個循環(huán)后,DNA擴(kuò)增2n倍。
1.變性:加熱 使模板DNA在高溫下(94℃)變性,雙鏈間的氫斷裂而形成兩條單鏈,即變性階段。
2.退火:使溶液溫度降至50-60℃,模板DNA與引物按堿基配對原則互補(bǔ)結(jié)全,即退火階段。
3.延伸:溶液反應(yīng)溫度升至72℃,耐熱DNA聚合酶以單鏈DNA為模板,在引物的引導(dǎo)下,利用反應(yīng)混合物中的4種脫氧核苷三磷酸(dNTP),按5’→3’方向復(fù)制出互補(bǔ)DNA,即引物的延伸階段。
上述3步為一個循環(huán),即高溫變性、低溫退火、中溫延伸3個階段。從理論上講,每經(jīng)過一個循環(huán),樣本中的DNA量應(yīng)該增加一倍,新形成的鏈又可成為新一輪循環(huán)的模板,經(jīng)過25-30個循環(huán)后DNA可擴(kuò)增106-109倍。
典型的RCP反應(yīng)體系由如下組分組成:DNA模板、反應(yīng)緩沖、dNTP、MgCl2、兩個合成的DNA引物、耐熱Taq聚合酶。
[實驗儀器與設(shè)備]
1.PCR基因擴(kuò)增儀
2.瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)
[實驗材料]
1. DNA模板 2. 4種dNTP
3. 引物1和引物2 4. Taq酶
5. 瓊脂糖 6. DNA Marker
7. tip 8.eppendorf管
9. 微量移液器
附試劑的配制:
1. 10×PCR緩沖液
500mmol/L KCl
PCR 技術(shù) ATCC細(xì)胞100mmol/L Tris·HCl(Ph8.3,室溫)
15mmol/L MgCl2
0.1% 明膠
2. 4×dNTP
10mmol/L dATP
10mmol/L dCTP
10mmol/L dGTP
10mmol/L dTTP
3. Taq酶 1u/μL
4. DNA模板 1ng/μL
5. 引物溶液濃度 10pmol/μL
[實驗步驟]
1.在0.5ml Eppendorf管內(nèi)配制25μL反應(yīng)體系
反應(yīng)物 體積/μL
ddH2O 11
10×PCR緩沖液 2.5
2.5mmol/L dNTP 2.0
25mmol/L MgCl2 1.5
引物1 1.0
引物2 1.0
模板DNA 5PCR 技術(shù) ATCC細(xì)胞
Taq酶 1
混勻,加25μL石蠟油.
2.按下述程序進(jìn)行擴(kuò)增
① 94℃預(yù)變性 5min
② 94℃變性 1min
③ 52℃退火 1min
④ 72℃延伸 1min
⑤ 重復(fù)步驟②-④35次
⑥ 72℃終延伸 10min
3.瓊脂糖凝膠電泳分析RCR結(jié)果
配制1.5%瓊脂糖凝膠,取10μL擴(kuò)增產(chǎn)物電泳。保持電流40mA.電泳結(jié)束后,用EB染色15min,紫外燈下觀察結(jié)果。

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