層析技術(shù) 傳代細(xì)胞
層析技術(shù)概述
引言
層析法又稱色層分析法或色譜法（Chromatography），它是在1903~1906年由俄國(guó)植物學(xué)家M. Tswett首先提出來(lái)的。他將葉綠素的石油醚溶液通過(guò)CaCO3管柱，并繼續(xù)以石油醚淋洗，由于CaCO3對(duì)葉綠素中各種色素的吸附能力不同，色素被逐漸分離，在管柱中出現(xiàn)了不同顏色的譜帶或稱色譜圖（Chromatogram）。
當(dāng)時(shí)這種方法并沒(méi)引起人們的足夠注意，直到1931年將該方法應(yīng)用到分離復(fù)雜的有機(jī)混合物，人們才發(fā)現(xiàn)了它的廣泛用途。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及生產(chǎn)實(shí)踐的需要，層析技術(shù)也得到了迅速的發(fā)展。為此作出重要貢獻(xiàn)的是英國(guó)生物學(xué)家Martin 和Synge，他們首先提出了色譜塔板理論。這是在色譜柱操作參數(shù)基礎(chǔ)上模擬蒸餾理論，以理論塔板來(lái)表示分離效率，定量的描述、評(píng)價(jià)層析分離過(guò)程。其次，他們根據(jù)液－液逆流萃取的原理，發(fā)明了液－液分配色譜。特別是他們提出了遠(yuǎn)見(jiàn)卓識(shí)的預(yù)言：一、流動(dòng)相可用氣體代替液體，與液體相比，物質(zhì)間的作用力減小了，這對(duì)分離更有好處；二、使用非常細(xì)的顆粒填料并在柱兩端施加較大的壓差，應(yīng)能得到zui小的理論塔板高（即增加了理論塔板數(shù)），這將會(huì)大大提高分離效率。前者預(yù)見(jiàn)了氣相色譜的產(chǎn)生，并在1952年誕生了氣相色譜儀，它給揮發(fā)性的化合物的分離測(cè)定帶來(lái)了劃時(shí)代的變革；后者預(yù)見(jiàn)了液相色譜（HPLC）的產(chǎn)生，在60年代末也為人們所實(shí)現(xiàn)，現(xiàn)在HPLC 已成為生物化學(xué)與分子生物學(xué)、化學(xué)等領(lǐng)域*的分析分離工具之一。
因此，Martin 和Synge 于1952年被授予諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。如今的色層分析法經(jīng)常用于分離無(wú)色的物質(zhì)，已沒(méi)有顏色這個(gè)特殊的含義，但色譜法或色層分析法這個(gè)名字仍保留下來(lái)沿用?，F(xiàn)在我們簡(jiǎn)稱為層析法或?qū)游黾夹g(shù)。層析法的zui大特點(diǎn)是分離效率高，它能分離各種性質(zhì)極相類似的物質(zhì)。而且它既可以用于少量物質(zhì)的分析鑒定，又可用于大量物質(zhì)的分離純化制備。因此，作為一種重要的分析分離手段與方法，它廣泛地應(yīng)用于科學(xué)研究與工業(yè)生產(chǎn)上?，F(xiàn)在，它在石油、化工、醫(yī)藥衛(wèi)生、生物科學(xué)、環(huán)境科學(xué)、農(nóng)業(yè)科學(xué)等領(lǐng)域都發(fā)揮著十分重要的作用。
層析的基本理論
層析法是一種基于被分離物質(zhì)的物理、化學(xué)及生物學(xué)特性的不同，使它們?cè)谀撤N基質(zhì)中移動(dòng)速度不同而進(jìn)行分離和分析的方法。例如：我們利用物質(zhì)在溶解度、吸附能力、立體化學(xué)特性及分子的大小、帶電情況及離子交換、親和力的大小及特異的生物學(xué)反應(yīng)等方面的差異，使其在流動(dòng)相與固定相之間的分配系數(shù)（或稱分配常數(shù)）不同，達(dá)到彼此分離的目的。
對(duì)于一個(gè)層析柱來(lái)說(shuō)，可作如下基本假設(shè)： 層析技術(shù) 傳代細(xì)胞
①層析柱的內(nèi)徑和柱內(nèi)的填料是均勻的，而且層析柱由若干層組成。每層高度為H，稱為一個(gè)理論塔板。塔板一部分為固定相占據(jù)，一部分為流動(dòng)相占據(jù)，且各塔板的流動(dòng)相體積相等，稱為板體積，以Vm 表示。
②每個(gè)塔板內(nèi)溶質(zhì)分子在固定相與流動(dòng)相之間瞬間達(dá)到平衡，且忽略分子縱向擴(kuò)散。
③溶質(zhì)在各塔板上的分配系數(shù)是一常數(shù)，與溶質(zhì)在塔板的量無(wú)關(guān)。
④流動(dòng)相通過(guò)層析柱可以看成是脈沖式的間歇過(guò)程（即不連續(xù)過(guò)程）。從一個(gè)塔板到另一個(gè)塔板流動(dòng)相體積為Vm。當(dāng)流過(guò)層析柱的流動(dòng)相的體積為V 時(shí)，則流動(dòng)相在每個(gè)塔板上跳越的次數(shù)為n:n1=v:v1。
⑤溶質(zhì)開(kāi)始加在層析柱的第零塔板上。根據(jù)以上假定，將連續(xù)的層析過(guò)程分解成了間歇的動(dòng)作，這與多次萃取過(guò)程相似，一個(gè)理論塔板相當(dāng)于一個(gè)兩相平衡的小單元。
層析的基本概念
（1）固定相
固定相是層析的一個(gè)基質(zhì)。它可以是固體物質(zhì)（如吸附劑，凝膠，離子交換劑等），也可以是液體物質(zhì)（如固定在硅膠或纖維素上的溶液），這些基質(zhì)能與待分離的化合物進(jìn)行可逆的吸附，溶解，交換等作用。它對(duì)層析的效果起著關(guān)鍵的作用。
（2）流動(dòng)相
在層析過(guò)程中，推動(dòng)固定相上待分離的物質(zhì)朝著一個(gè)方向移動(dòng)的液體、氣體或超臨界體等，都稱為流動(dòng)相。柱層析中一般稱為洗脫劑，薄層層析時(shí)稱為展層劑。它也是層析分離中的重要影響因素之一。
（3）分配系數(shù)及遷移率（或比移值）
分配系數(shù)是指在一定的條件下，某種組分在固定相和流動(dòng)相中含量（濃度）的比值，常用K 來(lái)表示。分配系數(shù)是層析中分離純化物質(zhì)的主要依據(jù)。 層析技術(shù) 傳代細(xì)胞
K = Cs / Cm
其中Cs: 固定相中的濃度，Cm: 流動(dòng)相中的濃度。
