ATCC細(xì)胞 凝膠層析法脫鹽和分離蛋白質(zhì)
（一）原理
凡鹽析所獲得的粗制蛋白質(zhì)（鹽析得到的IgG）中均含有硫酸銨等鹽類，這類將影響以后的純化，所以純化前均應(yīng)除去，此過(guò)程稱為“脫鹽”（desalthing）。脫鹽常用透析法和凝膠過(guò)濾法，這兩種方法各有利弊。前者的優(yōu)點(diǎn)是透析后析品終體積較小，但所需時(shí)間較長(zhǎng)，且鹽不易除盡；凝膠過(guò)濾法則能將鹽除盡，所需時(shí)間也短，但其凝膠過(guò)濾后樣品體積較大。所以，要根據(jù)具體情況選擇使用。前實(shí)驗(yàn)中樣品體積較小，凝膠達(dá)濾后樣品體積不會(huì)太增加，所以選用凝膠過(guò)濾法。
（二）試劑與器材
（1）Sephadex G-25。 ATCC細(xì)胞 凝膠層析法脫鹽和分離蛋白質(zhì)
（2）0.0175mol/L，pH6.7磷酸鹽緩沖液。
（3）奈氏（Nessler）試劑：于500ml錐形瓶?jī)?nèi)加入碘化鉀150g，碘110g，汞150g及蒸餾水100ml。用力振蕩7～15min，至碘的棕色開始轉(zhuǎn)變時(shí)，混合液溫度升高，將此瓶浸于冷水內(nèi)繼續(xù)振蕩，直到棕色的碘轉(zhuǎn)變?yōu)閹ЬG色的碘化鉀汞液為止。將上清液傾入2000ml量筒內(nèi)，加蒸餾水至2000ml，混勻備用。
（4）20%（W/V）磺基水楊酸溶液。
（5）1.5cm×20cm層析柱。
（6）黑、白比色磁盤。
（三）操作
（1）取層析柱1支（1.5cm×20cm），垂直固定在支架上，關(guān)閉下端出口。將已經(jīng)溶脹好的Sephadex G-25中的水傾倒出去，加入2倍體積的0.0175mol/L，pH6.7磷酸鹽緩沖液，并攪拌成懸浮液，然后灌注入柱，打開柱的下端出口，繼續(xù)加入攪勻的Sephadex G-25，使凝膠自然沉降高度到17cm左右，關(guān)閉出口。待凝膠柱形成后，在洗脫瓶中加入0.0175mol/L，pH6.7磷酸鹽緩沖液以3倍柱體積的磷酸鹽緩沖流過(guò)凝膠柱，以平衡凝膠。
（2）凝膠平衡后，用皮頭滴管除去凝膠柱面的溶液，將鹽析所得全部IgG樣品加到凝膠柱表面，打開柱下口，控制流速讓IgG樣品溶液慢慢浸入凝膠內(nèi)。凝膠柱面上加一層的0.0175mol/L，pH6.7磷酸鹽緩沖液，并用此緩沖液洗脫，控制流速為0.5ml/min左右。用試管收集洗脫液，每管10滴。
（3）在開始收集洗脫液的同時(shí)檢查蛋白質(zhì)是否已開始流出。為此，由每支收集管中取出1滴溶液置于黑色比色磁盤中，加入1滴20%磺基水楊酸，若呈現(xiàn)白色絮狀沉淀即證明已有蛋白質(zhì)出現(xiàn)，直到檢查不出白色沉淀時(shí)，停止收集洗脫液。
（4）由經(jīng)檢查含有蛋白質(zhì)的每管中，取1滴溶液，放置在白色比色盤孔中，加入1滴奈氏試劑，若呈現(xiàn)棕黃色沉淀說(shuō)明它含有硫酸銨。合并檢查后不含硫酸銨的各管收集液，即為“脫鹽”后的IgG。
注意：在檢測(cè)時(shí)，用皮頭滴管吸取管中溶液后應(yīng)及時(shí)洗凈，再吸取下一管，以免造成相互污染假象。
附：凝膠過(guò)濾法原理及基本操作
1．原 理 ATCC細(xì)胞 凝膠層析法脫鹽和分離蛋白質(zhì)
凝膠過(guò)濾（gel filtration），又稱為凝膠層析（gel chromatography）、分子篩過(guò)濾（molecular sieve filtration）、凝膠滲透層析（gel osmotic chromatography）等。它是20世紀(jì)60年代發(fā)展起來(lái)的一種層析技術(shù)。其基本原理是利用被分離物質(zhì)分子大小不同及固定相（凝膠）具有分子篩的特點(diǎn)，將被分離物質(zhì)各成分按分子大小分開，達(dá)到分離的方法。
凝膠是由膠體粒子構(gòu)成的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。網(wǎng)眼里吸滿水后凝膠膨脹呈柔軟而富于彈性的半固體狀態(tài)。人工合成的凝膠網(wǎng)眼較均勻地分布在凝膠顆粒上有如篩眼，小于篩眼的物質(zhì)分子均可通過(guò)，大于篩眼的物質(zhì)分子則不能，故稱為“分子篩”。凝膠之所以能將不同分子的物質(zhì)分開是因?yàn)楫?dāng)被分離物質(zhì)的各成分通過(guò)凝膠時(shí)，小于篩眼的分子將*滲入凝膠網(wǎng)眼，并隨著流動(dòng)相的移動(dòng)沿凝膠網(wǎng)眼孔道移動(dòng)，從一個(gè)顆粒的網(wǎng)眼流出，又進(jìn)入另一顆粒的網(wǎng)眼，如此連續(xù)下去，直到流過(guò)整個(gè)凝膠柱為止，因而流程長(zhǎng)、阻力大、流速慢；大于篩眼的分子則*被篩眼排阻而不能進(jìn)入凝膠網(wǎng)眼，只能隨流動(dòng)相沿凝膠顆粒的間隙流動(dòng)，其流程短、阻力小、流速快，比小分子先流出層析柱；小分子zui后流出。分子大小介于*排阻不能進(jìn)入或*滲入凝膠篩眼之間的物質(zhì)分子，則居中流出。這樣被分離物質(zhì)即被按分子的大小分開。
用于凝膠層析的凝膠均為人工合成的產(chǎn)品，主要有交聯(lián)葡聚糖（商品名為Sephadex）、瓊脂糖（商品名為Sepharose）、聚丙烯酰胺凝膠（商品名為Bio–gel）及具有一定網(wǎng)眼的細(xì)玻璃珠等和這些凝膠的衍生物。
下面主要介紹葡聚糖凝膠，這是由葡萄糖的多聚物與1–氯– 2、3–環(huán)氧丙烷交連而成。環(huán)氧丙烷引入丙三醇基將鏈狀的多聚葡萄糖單位交聯(lián)起來(lái)，凝膠網(wǎng)眼的大小由多聚葡萄糖的分子和環(huán)氧丙烷的比例（交聯(lián)度）來(lái)控制。
