中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞CHO細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)概述
無(wú)菌操作基本技術(shù)
1. 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前，無(wú)菌室及無(wú)菌操作臺(tái)（laminar flow） 以紫外燈照射30-60 分鐘滅菌，以70 % ethanol 擦拭無(wú)菌操作抬面，并開(kāi)啟無(wú)菌操作臺(tái)風(fēng)扇運(yùn)轉(zhuǎn)10 分鐘后，才開(kāi)始實(shí)驗(yàn)操作。每次操作只處理一株細(xì)胞株，且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基，以避免失誤混淆或細(xì)胞間污染。實(shí)驗(yàn)完畢后，將實(shí)驗(yàn)物品帶出工作臺(tái)，以70 % ethanol 擦拭無(wú)菌操作抬面。操作間隔應(yīng)讓無(wú)菌操作臺(tái)運(yùn)轉(zhuǎn)10 分鐘以上后，再進(jìn)行下一個(gè)細(xì)胞株之操作。
2. 無(wú)菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時(shí)放置，其它實(shí)驗(yàn)用品用完即應(yīng)移出，以利于氣流之流通。實(shí)驗(yàn)用品以70 % ethanol 擦拭后才帶入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在抬面之中央無(wú)菌區(qū)域，勿在邊緣之非無(wú)菌區(qū)域操作。
3. 小心取用無(wú)菌之實(shí)驗(yàn)物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開(kāi)之容器正上方操作實(shí)驗(yàn)。容器打開(kāi)后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45° 角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。
中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞CHO細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)概述4. 工作人員應(yīng)注意自身之安全，須穿戴實(shí)驗(yàn)衣及手套后才進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)于來(lái)自人類或是病毒感染之細(xì)胞株應(yīng)特別小心操作，并選擇適當(dāng)?shù)燃?jí)之無(wú)菌操作臺(tái)（至少Class II）。操作過(guò)程中，應(yīng)避免引起aerosol 之產(chǎn)生，小心毒性藥品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖銳針頭之傷害等。
5. 定期檢測(cè)下列項(xiàng)目：
5.1. CO2 鋼瓶之CO2 壓力
5.2. CO2 培養(yǎng)箱之CO2 濃度、溫度、及水盤(pán)是否有污染（水盤(pán)的水用無(wú)菌水，每周更換）。
5.3. 無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)之a(chǎn)irflow 壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA 過(guò)濾膜，預(yù)濾網(wǎng)（300 小時(shí)/預(yù)濾網(wǎng),3000 小時(shí)/HEPA）。
6. 水槽可添加消毒劑（Zephrin 1:750），定期更換水槽的水。
實(shí)驗(yàn)用品
1. 種類︰
1.1. 細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)用品均為無(wú)菌，除了玻璃容器與pasteur pipet 外，其它均為塑料無(wú)菌制品。
1.2. TC 級(jí)培養(yǎng)盤(pán)表面均有coating 高分子物質(zhì)以讓細(xì)胞吸附，培養(yǎng)容器種類有Tflask, plates, dishes, roller bottle 等，依實(shí)驗(yàn)需要使用。
1.3. plastic sterile pipet: 1 ml, 2 ml,5 ml, 10 ml, 25 ml
1.4. 塑料離心管: 15 ml, 50 ml，均有2 種不同材質(zhì)，其中polypropylene （PP） 為不透明材質(zhì)，polystyrene （PS） 為透明材質(zhì)，可依實(shí)驗(yàn)需要而選擇適合材質(zhì)之離心管。
1.5. glass pastuer pipet: 9 inch，用以抽掉廢棄培養(yǎng)液等。
1.6. 玻璃血清瓶（Pyrex or Duran glassware）：100 ml, 250 ml,500 ml,1000 ml
2. 清洗︰
2.1. 新購(gòu)玻璃血清瓶先以0.1~0.05 N HCl 浸泡數(shù)小時(shí)，洗凈后才開(kāi)始使用。
2.2. 用過(guò)之玻璃血清瓶，以高壓蒸汽滅菌，洗凈后分別用一次與二次去離子水沖洗干凈，勿加清潔劑清洗。
3. 滅菌︰
3.1. 實(shí)驗(yàn)用玻璃血清瓶以鋁箔紙包覆瓶蓋，高壓蒸汽滅菌121 oC, 15 lb, 20 分鐘，置于oven 中烘干。
3.2. 實(shí)驗(yàn)用玻璃pasteur pipet 以干熱滅菌170 oC, 4 小時(shí)。
3.3. 液體或是固體廢棄物可用10 % hypochloride 溶液（次氯酸，即漂白水） 或是蒸汽高壓滅菌121 oC, 15 lb, 20 分鐘處理。
中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞CHO細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)概述培養(yǎng)基
1. 液體培養(yǎng)基貯存于4 oC 冰箱，避免光照，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前放在37 oC 水槽中溫?zé)帷?/div>
2. 液體培養(yǎng)基（加血清） 存放期為六個(gè)月，期間glutamine 可能會(huì)分解，若細(xì)胞生長(zhǎng)不佳，可以再添加適量glutamine。
3. 粉末培養(yǎng)基配制（以1 升為例）：
3.1. 細(xì)胞培養(yǎng)基通常須添加10 % 血清，因此粉末培養(yǎng)基之配制體積為900 ml，pH 為7.2 - 7.4。NaHCO3 為另外添加，若將NaHCO3 粉末直接加入液體培養(yǎng)基中會(huì)造成pH 之誤差，或局部過(guò)堿。因此粉末培養(yǎng)基及NaHCO3 粉末應(yīng)分別溶解后才混合，然后用CO2 氣體調(diào)整pH，而非用強(qiáng)酸（HCl）或強(qiáng)堿（NaOH），因?yàn)槁入x子對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)可能有影響，且貯存時(shí)培養(yǎng)基的pH 易發(fā)生改變。
3.2. 材料：
3.2.1. 純水（milli-Q 水或二次至三次蒸餾水，水品質(zhì)非常重要）
3.2.2. 粉末培養(yǎng)基
3.2.3. NaHCO3 （Sigma S-4019）
3.2.4. 電磁攪拌器
3.2.5. 無(wú)菌血清瓶
3.2.6. 0.1 或0.2 mm無(wú)菌過(guò)濾膜
3.2.7. pH meter
3.2.8. 真空幫浦
3.2.9. CO2 氣體
3.3. 步驟：
3.3.1. 取粉末培養(yǎng)基溶于700 ml milli-Q 水中，攪拌使其溶解。
3.3.2. 稱取適量之NaHCO3 粉末（數(shù)量依培養(yǎng)基種類而異，表一）溶于200mlmilli-Q 水中，攪拌使其溶解，然后通入CO2 氣體至飽和，約3-5 分鐘。
3.3.3. 將溶解且含飽和CO2 之NaHCO3 溶液加入溶解之液體培養(yǎng)基中混合?；旌?溶液之pH 應(yīng)為7.2-7.4，除非pH 值偏差太大，否則不需用酸堿再調(diào)整之。 若為太堿，可再通入CO2 氣體調(diào)整pH。培養(yǎng)基以真空幫浦通過(guò)過(guò)濾膜時(shí)，pH 會(huì)升高0.1-0.2。
3.3.4. 以0.1 或0.2 mm 無(wú)菌過(guò)濾膜過(guò)濾滅菌，同時(shí)分裝至無(wú)菌容器中，標(biāo)示培養(yǎng)基種類、日期、瓶號(hào)等，貯存于4 oC。（血清亦可加入培養(yǎng)基中一起過(guò)濾）
3.3.5. 配制之培養(yǎng)基配制須作生長(zhǎng)試驗(yàn)與污染測(cè)試。
4. 配制培養(yǎng)基之生長(zhǎng)測(cè)試
4.1. 材料：
4.1.1. MDCK cell （ATCC CCL-34 或CCRC 60004）
4.1.2. 6-well TC plate （or 35 mm TC dish）
4.1.3. methanol
4.1.4. glacial acetic acid
4.1.5. 10 % Giemsa solution （GibcoBRL 10092-013）
中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞CHO
中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞 K1（亞系克隆）CHO-K1
中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞CHO/dhFr
倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞二氫葉酸還原酶缺陷CHO/dhFr-
中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞CTLA4 Ig-24
牛胚氣管細(xì)胞EBTr （NBL-4）
倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞Lec1
雞胚成纖維細(xì)胞UMNSAH/DF-1
豚鼠胚胎細(xì)胞104C1
中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞7WCY1.0
中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞7WD10
中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞7WML6.0
中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞7WPS1
小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞TM3
正常小鼠睪丸 Sertoli細(xì)胞TM4
昆蟲(chóng)卵巢細(xì)胞SF9
豬胎睪丸傳代細(xì)胞ST
中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（亞系克?。〤HO-HCV-C
興國(guó)鯉尾鰭細(xì)胞XGL
猴脈絡(luò)膜-視網(wǎng)膜（內(nèi)皮）細(xì)胞RF/6A
新生牛眼晶體上皮細(xì)胞NBLE
新生牛眼 Tenon's囊成纖維細(xì)胞NBTF
鼠舌黏膜鱗癌細(xì)胞Rca-T
鼠頰黏膜鱗癌細(xì)胞Rca-B
幼蚊細(xì)胞C6/36
大鼠肺泡巨噬細(xì)胞NR8383
大鼠氣管上皮細(xì)胞RTE
大鼠肺成纖維樣細(xì)胞RL1
大鼠肺細(xì)胞WTRL1
大鼠胸大動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞A7r5
大鼠心肌細(xì)胞H9c2（2-1）
大鼠肝細(xì)胞瘤H-4-Ⅱ-E
大鼠肝細(xì)胞IAR20
大鼠肝細(xì)胞瘤H4-Ⅱ-E-C3
大鼠肝細(xì)胞BRL
大鼠肝細(xì)胞BRL 3A
大鼠肝癌細(xì)胞RH-35
大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞PC-12
正常大鼠腎細(xì)胞NRK
大鼠腎小球系膜細(xì)胞HBZY-1
大鼠腎細(xì)胞RK1
大鼠腎細(xì)胞NRK-52E
大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞（低分化）PC-12
大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞（高分化）PC-12
