人外周血染色體制備 人胚肺成纖維細胞CCC-HPF-1細胞
1.?實驗原理 人的外周血淋巴細胞培養(yǎng)方法是1960年由Moorhead?提出來的。正常情況下，人外周血小淋巴細胞都處在G1期（或G0期），但在體外給予一定的條件，進行培養(yǎng)，經(jīng)72 h就可獲得大量的有絲分裂細胞。這種取材簡易、用血量少的培養(yǎng)方法已被廣泛采用。
在培養(yǎng)液中加入植物血凝素（PHA），淋巴細胞受到刺激可轉化為淋巴母細胞，進入有絲分裂。短期培養(yǎng)后，經(jīng)秋水仙素處理，可抑制細胞分裂時紡錘絲的形成，使細胞分裂停止在中期，同時它可改變細胞質的黏度，引起染色體在細胞質中分散。經(jīng)低滲和固定，即可得到大量的、分散效果好的染色體分裂象。人體的1ml外周血中一般含有約（1～3）×106個小淋巴細胞，足夠染色體標本制備和分析之用。本節(jié)介紹人外周血淋巴細胞的懸浮培養(yǎng)法，以及染色體標本的制備。
2.?試劑與器材
（1）2ml注射器、培養(yǎng)瓶、刻度吸管，需15磅滅菌20min。離心管、吸管、量筒、載玻片，經(jīng)洗液按常規(guī)清洗、烘干備用。
（2）超凈工作臺，恒溫培養(yǎng)箱，天平，離心機、顯微鏡等。
（3）試劑：
① 培養(yǎng)基的配制：
RPMI 1640培養(yǎng)基?????4ml
人外周血染色體制備 人胚肺成纖維細胞CCC-HPF-1細胞小牛血清????????????1ml
青霉素和鏈霉素??????各100IU/ml
PHA?????????????????0.2ml
肝素????????????????1小滴
以5% NaHCO3調pH至7.2～7.4, 4℃?zhèn)溆谩?/div>
② 肝素：稱取0.2g溶于100ml雙蒸水中，濃度為0.2%，滅菌。
③ 秋水仙素：生理鹽水配制成20μg/ml濃度，滅菌，分裝，置－20℃。
④ 低滲液：0.075mol/L KCl。
⑤ 固定液： 甲醇∶冰乙酸（3∶1），臨時配制。
⑥?Giemsa工作液：1份原液和９份磷酸緩沖液，臨時配制。
⑦ 磷酸緩沖液：1/15mol/L Na2HPO4、1/15mol/L KH2PO4等體積混合。
⑧?5% NaHCO3滅菌濾器抽濾備用。
3.?實驗步驟
（1）接種，培養(yǎng)。
① 在無菌條件下，用滅菌注射器吸取0.2%肝素液（生理鹽水配制，滅菌）0.2ml，濕潤針筒后，采靜脈血1～2ml、轉動注射器使血液與肝素充分混勻。
② 無菌條件下，將肝素化血液滴入至外周血培養(yǎng)基內，每5ml培養(yǎng)液內滴入血滴28～30滴（7號針頭）輕輕混勻。
③ 置37℃恒溫箱內，靜止培養(yǎng)68～72h。注意第二天觀察培養(yǎng)液有無凝血、溶血或長菌的現(xiàn)象，可每天將培養(yǎng)液搖一搖以便細胞得到充分培養(yǎng)。
人外周血染色體制備 人胚肺成纖維細胞CCC-HPF-1細胞④ 終止培養(yǎng)前2～3h，加入濃度為20μg/ml的秋水仙素，每5ml培養(yǎng)基中用7號針頭，加3～4滴使zui終濃度為0.1μg/ml。輕輕搖勻后，再放入恒溫箱內，繼續(xù)培養(yǎng)2～3h，以積累較多停止在中期的分裂象。
（2）制片。
① 收獲細胞：由恒溫箱取出培養(yǎng)瓶，用吸管充分吹打培養(yǎng)瓶瓶壁，使細胞全部脫離瓶壁，然后將細胞液移至錐形離心管內，1500轉/min，離心10min，去上清液。
② 低滲處理：加入37℃預溫的0.075mol/L KCl 8ml，反復吹打（約一百次）后，置37℃水浴箱中低滲處理25min左右。
③ 預固定：加入新鮮制備固定液1ml（甲醇∶冰醋酸=3∶1），輕輕混勻。
④ 離心：2000轉/min，離心10min，吸棄上清液。
⑤ 固定：沿離心管壁慢慢加入固定液8ml，輕輕混勻，固定10min。
⑥ 離心：同上，吸去上清液。
⑦ 再固定：加固定液8ml，混勻，固定10min。
⑧ 離心：同上，吸去上清液。
⑨ 制細胞懸液：根據(jù)細胞量多少，加入適量固定液，充分混勻，制成細胞懸液。
⑩ 滴片：取出預先經(jīng)冰水浸泡的載玻片，用吸管吸取混勻的細胞懸液在離冰片約30cm距離進行滴片，每片約滴2～3滴細胞懸液，使細胞較好分散。一般每一培養(yǎng)瓶可制3～5張標本片。
{11}?染色：標本晾干后，即可用染液（Giemsa液原液1份，pH6.8的磷酸緩沖液9份）染色15min，自來水沖洗后（從背面沖洗）晾干。
（3）鏡檢：人類每個體細胞有46條染色體，根據(jù)染色體的長度和著絲粒位置的不同，可以分成22對常染色體和一對性染色體，男子是46，XY；女子是46，XX。
