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谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠 4B使用說明書

時間:2018/3/26閱讀:2411
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谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠 4B使用說明書由上海遠(yuǎn)慕生物詳細(xì)介紹,本司現(xiàn)貨供應(yīng)ELISA試劑盒,標(biāo)準(zhǔn)品對照品,動物血清,培養(yǎng)基,抗體,細(xì)胞株,瓊脂糖凝膠,葡聚糖凝膠,多肽,酶類,碳水化合物,生物分子,微生物,生化試劑,化學(xué)試劑,實驗耗材,染色液,其他試劑等,歡迎訂購!

 

【谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠 4B參數(shù)說明】

中文名:谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠 4B

英文名:Glutathione Sepharose 4B 

供應(yīng)商:上海遠(yuǎn)慕

規(guī)格:10ml、50ml

操作溫度:4-40℃

結(jié)構(gòu)成分:4%交聯(lián)瓊脂糖

配基偶聯(lián)量:40μmol phenyl/ml 凝膠

保存條件:4℃

性狀:白色微球,凝膠狀,保存在20%酒精溶液中

應(yīng)用:疏水層析介質(zhì),適合含芳香族配體蛋白純化,特別適合單抗的純化等

谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠 4B使用說明

谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠 4B使用說明

 

【谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠 4B使用方法】 

谷胱甘肽樹脂的處理:

1、輕輕顛倒盛有谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂的容器,將樹脂混成勻漿。

2、取部分勻漿放入15mL聚丙烯管(每100mL細(xì)菌培養(yǎng)物大約需要2mL勻漿)。

3、4℃500g離心5分鐘,小心去掉上清。

4、在樹脂中加入10倍柱床體積預(yù)冷的PBS,顛倒數(shù)次混勻,4℃500g離心5分鐘,小心去掉上清。

5、每毫升樹脂加入1毫升冷的PBS,制成50%勻漿,顛倒數(shù)次,混合均勻,懸液冰上放置待用。

制備細(xì)胞抽提物:

1、每100毫升培養(yǎng)物的細(xì)胞沉淀重懸于4mLPBS緩沖液中。

2、加入溶菌酶至終濃度為1mg/mL,冰上放置30分鐘。

3、用針筒將10mL濃度為0.2%的TritonX-*行注入黏稠的細(xì)胞裂解物中,劇烈振動數(shù)次混勻;加入DNase和RNase至終濃度5ug/mL,4℃振動溫育10分鐘,4℃3000g離心30分鐘,去除不溶性細(xì)胞碎片,上清轉(zhuǎn)移到一只新管中,加入DTT至終濃度1mmol/L。

純化融合蛋白:

1、細(xì)胞裂解物與適量50%谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂勻漿混和,每100毫升細(xì)菌培養(yǎng)物加2mL樹脂,于室溫輕搖30min。

2、混合物于4℃以500g離心5分鐘,小心去掉上清并留樣少許進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。

3、沉淀中加入10倍柱床體積的冷的PBS,顛倒離心管數(shù)次混勻,洗去未與樹脂結(jié)合的蛋白。

4、4℃以500g離心5分鐘,小心去掉上清并留樣少許進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。

5、重復(fù)步驟11和12兩次。

6、結(jié)合的GST融合蛋白可用谷胱甘肽洗脫液洗脫,也可用凝血酶、腸激酶或Xa因子切割,釋放靶蛋白。用谷胱甘肽洗脫融合蛋白:

7、沉淀中加入1倍柱床體積的谷胱甘肽洗脫緩沖液,室溫輕輕攪動10min,洗脫樹脂小心去掉上清。

8、每毫升樹脂加入1毫升冷的PBS,制成50%勻漿,顛倒數(shù)次,混合均勻,懸液冰上放置待用。制備細(xì)胞抽提物:

9、每100毫升培養(yǎng)物的細(xì)胞沉淀重懸于4mLPBS緩沖液中。7.加入溶菌酶至終濃度為1mg/mL,冰上放置30分鐘。

10、用針筒將10mL濃度為0.2%的TritonX-*行注入黏稠的細(xì)胞裂解物中,劇烈振動數(shù)次混勻。加入DNase和RNase至終濃度5ug/mL,4℃振動溫育10分鐘,4℃3000g離心30分鐘,去除不溶性細(xì)胞碎片,上清轉(zhuǎn)移到一只新管中,加入DTT至終濃度1mmol/L。

純化融合蛋白:

1、細(xì)胞裂解物與適量50%谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂勻漿混和,每100毫升細(xì)菌培養(yǎng)物加2mL樹脂,于室溫輕搖30min。

2、混合物于4℃以500g離心5分鐘,小心去掉上清并留樣少許進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。

3、沉淀中加入10倍柱床體積的冷的PBS,顛倒離心管數(shù)次混勻,洗去未與樹脂結(jié)合的蛋白。

4、4℃以500g離心5分鐘,小心去掉上清并留樣少許進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。

5、重復(fù)步驟11和12兩次。

6、結(jié)合的GST融合蛋白可用谷胱甘肽洗脫液洗脫,也可用凝血酶、腸激酶或Xa因子切割,釋放靶蛋白。

用谷胱甘肽洗脫融合蛋白: 

1、沉淀中加入1倍柱床體積的谷胱甘肽洗脫緩沖液,室溫輕輕攪動10min,洗脫樹脂上結(jié)合的蛋白。

2、4℃以500g離心5分鐘,上清(含洗脫的融合蛋白)移至新管中。

3、重復(fù)步驟a和b兩次,合并3次上清。蛋白酶解從結(jié)合的GST融合蛋白上回收靶蛋白:

4、在結(jié)合了融合蛋白的樹脂中加入凝血酶、腸激酶或Xa因子(根據(jù)融合蛋白中的位點選擇),每mL樹脂加入50單位溶于1mLPBS的蛋白酶。顛倒離心管數(shù)次混勻,室溫下振蕩2—16小時。用小規(guī)模實驗確定時間。19.4℃以500g離心5分鐘,上清小心移至新管中。(GST仍結(jié)合在樹脂上,而靶蛋白在上清中,蛋白酶也在上清中,仍需要分離)20.10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析每一步樣品的蛋白質(zhì)組成。

試劑配制:

谷胱甘肽洗脫緩沖液:10mmol/L還原型谷胱甘肽,50mmol/LTris-Cl(pH8.0)

相關(guān)試劑:

PMSF(100mM)

溶菌酶(100mg/mL)

IPTG溶液(50mg/mL)

1MTris-HCl(PH=8.0)

SDS-PAGE凝膠制備試劑盒

His標(biāo)簽純化樹脂(Ni-NTAResin)

預(yù)染低分子量蛋白MARKER

BCA蛋白濃度測定試劑盒

 

【谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠 4B說明】

pGEX載體表達(dá)的外源蛋白與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶融合,因此可以通過谷胱甘肽-瓊脂糖親和層析進(jìn)行純化。GSTs是一類以谷胱甘肽(γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸)作為底物,通過形成硫醇尿酸失活毒性小分子的酶。由于GST對底物的親和力是亞毫摩爾級的,因此谷胱甘肽固化于瓊脂糖形成的親和層析樹脂對GST及其融合蛋白的純化效率很高??梢杂煤坞x谷胱甘肽的緩沖液洗脫結(jié)合GST融合蛋白;樹脂用3mol/LNaCl的緩沖液再生;谷胱甘肽瓊脂糖對GST融合蛋白的結(jié)合能力很強(每毫升柱床體積的樹脂能結(jié)合8毫克融合蛋白)。

 

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