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中級(jí)會(huì)員 | 第12年

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細(xì)胞凋亡的幾種檢測(cè)方法

時(shí)間:2016/6/15閱讀:1408
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  一、形態(tài)學(xué)觀察方法
  
  1、HE染色、光鏡觀察:凋亡細(xì)胞呈圓形,胞核深染,胞質(zhì)濃縮,染色質(zhì)成團(tuán)塊狀,細(xì)胞表面有“出芽”現(xiàn)象。
  
  2、丫啶橙(AO)染色,熒光顯微鏡觀察:活細(xì)胞核呈黃綠色熒光,胞質(zhì)呈紅色熒光。凋亡細(xì)胞核染色質(zhì)呈黃綠色濃聚在核膜內(nèi)側(cè),可見(jiàn)細(xì)胞膜呈泡狀膨出及凋亡小體。
  
  3、臺(tái)盼藍(lán)染色:如果細(xì)胞膜不完整、破裂,臺(tái)盼藍(lán)染料進(jìn)入細(xì)胞,細(xì)胞變藍(lán),即為壞死。如果細(xì)胞膜完整,細(xì)胞不為臺(tái)盼藍(lán)染色,則為正常細(xì)胞或凋亡細(xì)胞。此方法對(duì)反映細(xì)胞膜的完整性,區(qū)別壞死細(xì)胞有一定的幫助。
  
  4、透射電鏡觀察:可見(jiàn)凋亡細(xì)胞表面微絨毛消失,核染色質(zhì)固縮、邊集,常呈新月形,核膜皺褶,胞質(zhì)緊實(shí),細(xì)胞器集中,胞膜起泡或出“芽”及凋亡小體和凋亡小體被臨近巨噬細(xì)胞吞噬現(xiàn)象。
  
  二、DNA凝膠電泳
  
 ?。ㄒ唬z測(cè)原理
  
  細(xì)胞發(fā)生凋亡或壞死,其細(xì)胞DNA均發(fā)生斷裂,細(xì)胞內(nèi)小分子量DNA片斷增加,高分子DNA減少,胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)DNA片斷。但凋亡細(xì)胞DNA斷裂點(diǎn)均有規(guī)律的發(fā)生在核小體之間,出現(xiàn)180-200bpDNA片斷,而壞死細(xì)胞的DNA斷裂點(diǎn)為無(wú)特征的雜亂片斷,利用此特征可以確定群體細(xì)胞的死亡,并可與壞死細(xì)胞區(qū)別。
  
  (二)結(jié)果判斷
  
  正?;罴?xì)胞DNA電泳出現(xiàn)階梯狀(LADDER)條帶;壞死細(xì)胞DNA電泳類似血抹片時(shí)的連續(xù)性條帶。
  
  三、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)核小體測(cè)定
  
  凋亡細(xì)胞的DNA斷裂使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)核小體。核小體由組蛋白及其伴隨的DNA片斷組成,可由ELISA法檢測(cè)。
  
  (一)檢測(cè)步驟
  
  1、將凋亡細(xì)胞裂解后高速離心,其上清液中含有核小體;
  
  2、在微定量板上吸附組蛋白體’
  
  3、加上清夜使抗組蛋白抗體與核小體上的組蛋白結(jié)合‘
  
  4、加辣過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗DNA抗體使之與核小體上的DNA結(jié)合’
  
  4、加酶的底物,測(cè)光吸收制。
  
 ?。ǘ┯猛?br />  
  該法敏感性高,可檢測(cè)5*100/ml個(gè)凋亡細(xì)胞??捎糜谌?、大鼠、小鼠的凋亡檢測(cè)。該法不需要特殊儀器,適合基層工作,但是不能測(cè)定凋亡細(xì)胞發(fā)生的絕多對(duì)量。
  
  四、流式細(xì)胞儀定量分析
  
 ?。ㄒ唬z測(cè)原理
  
  細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí),其細(xì)胞膜的通透性也增加,但是其程度介于正常細(xì)胞與壞死細(xì)胞之間。利用這一特點(diǎn),被檢測(cè)細(xì)胞懸液用熒光素染色,利用流式細(xì)胞儀測(cè)量細(xì)胞懸液中細(xì)胞熒光強(qiáng)度來(lái)區(qū)分正常細(xì)胞、壞死細(xì)胞核凋亡細(xì)胞。
  
  (二)應(yīng)用價(jià)值
  
  流式細(xì)胞儀檢測(cè)具有以下特點(diǎn):
  
  1)、檢測(cè)的細(xì)胞數(shù)量大,因此其反映群體細(xì)胞的凋亡狀態(tài)比較準(zhǔn)確
  
  2)、可以做許多相關(guān)性分析
  
  3)、結(jié)合被檢測(cè)細(xì)胞的DNA含量的分析,可確定凋亡的細(xì)胞所處的細(xì)胞周期

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