材料及試劑

1. 磁性激活細(xì)胞分離器（MACS）：MACS柱（C型，可結(jié)合2×108 個(gè)細(xì)胞）生物素標(biāo)記的抗CD4單抗和抗CD8單抗

2. 生物素標(biāo)記的羊抗鼠IgG F(Fab)2

3. FITC標(biāo)記的親和素

4. 生物素標(biāo)記的磁性微珠

5. MACS柱染色洗滌液、MACS柱洗脫液（含1%牛血清白蛋白的PBS）和MACS柱

6. 浸濕液（含10%牛血清白蛋白的PBS）

7. 人懸液或淋巴細(xì)胞懸液

8. RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液

操作方法

1. MACS柱的準(zhǔn)備新MACS柱需高壓滅菌，60℃烘干后備用。使用前（至少2h前）應(yīng)準(zhǔn)備完畢。將2～3個(gè)C型MACS柱內(nèi)分別用10ml注射器在柱下三通閥們處加入10mlMACS柱浸濕液，使液面達(dá)到柱內(nèi)鐵絲基質(zhì)平面上2～3Cm處，關(guān)閉柱下三道閥們備用；

2. 將人PBMC懸液或淋巴細(xì)胞懸液（含2×10 8  個(gè)細(xì)胞）離心，重新懸浮于0.15ml MACS染色洗滌液中，加入生物素標(biāo)記的CD4單抗和抗CD8單抗各25ul（比例為0.05ug/10 6 個(gè)細(xì)胞），冰浴孵育25min。用MACS染色洗滌液洗滌2次后（1500r/min,5min），重新懸浮與0.15ml MACS染色洗滌液中，加入50ul生物素標(biāo)記的羊抗鼠IgG F(Fab) 2 （比例為0.05ug/10 6 個(gè)細(xì)胞），冰浴孵育25min。用MACS染色洗滌液洗滌2次后（1500r/min，5min），重新懸浮與0.15ml MACS染色洗滌液中，加入50ul FITC標(biāo)記的親和素（比例為0.08ug/10 6 個(gè)細(xì)胞），冰浴孵育15min。用MACS染色洗滌液洗滌2次后（1500r/min,5min），重新懸浮與0.15ml MACS染色洗滌液中，加入生物素標(biāo)記的磁性微珠（比例為5ul/10 8 個(gè)細(xì)胞），冰浴孵育5～10min。在加入3ml MACS柱洗脫液；

3. 將MACS柱放入MACS磁鐵槽內(nèi)，用20ml MACS柱洗脫液洗柱，待液體降至柱內(nèi)鐵絲基質(zhì)平面上2～3處，關(guān)閉三通閥們。將細(xì)胞懸液置于MACS柱內(nèi)。在柱下放一支50ml的試管，打開閥們，使其流速為3～5ml/min，邊流邊加MACS柱洗脫液，每個(gè)柱內(nèi)至少加柱洗脫液30ml。試管內(nèi)的洗脫液中為CD4-CD8-細(xì)胞（即陰性分離）。離心洗滌后調(diào)整細(xì)胞至所需濃度備用；

4. 將MACS柱移出磁場(chǎng)外，用MACS柱洗脫液洗柱（較大流速），則該洗脫液中為CD4+、CD8+或CD4+CD8+細(xì)胞（即陽(yáng)性分離）。離心洗滌后調(diào)整細(xì)胞至所需濃度備用；

5. 再用另外兩個(gè)MACS柱重復(fù)上述過柱過程，以提高細(xì)胞分離純度；

6. 結(jié)果評(píng)價(jià)：分別取上述兩種細(xì)胞懸液個(gè)0.5ml，在流式細(xì)胞儀(FCM)上進(jìn)行測(cè)定分析，F(xiàn)ITC陰性細(xì)胞（陰性分離細(xì)胞）為CD4-、CD8-細(xì)胞，而FITC陽(yáng)性細(xì)胞（陽(yáng)性分離細(xì)胞）為CD4+、CD8+或細(xì)胞CD4+CD8+細(xì)胞。如果FITC陰性細(xì)胞中FITC陽(yáng)性細(xì)胞率高于5%～10%，則需重復(fù)進(jìn)行MACS分離過程。MACS分離細(xì)胞具有高純度（一般為95%～99%）等特點(diǎn)。其分離效果與流式細(xì)胞儀的細(xì)胞分離效果相媲美，并具有比流式細(xì)胞儀分離術(shù)經(jīng)濟(jì)、省事節(jié)時(shí)、操作簡(jiǎn)單、快速等優(yōu)點(diǎn)。

注意事項(xiàng)

1. MACS柱用畢后需立即用雙蒸水沖洗干凈（或用同等柱體積量的PBS洗滌20次），再以20倍于柱體積的無菌雙蒸水和5倍于柱體積的95%乙醇溶液洗滌，37℃下烘干，高壓滅菌備用。

2. 有各種不同容量的MACS柱，可根據(jù)需要選擇。

3. 不要將組織塊或大細(xì)胞團(tuán)塊加入柱內(nèi)，以免造成堵塞進(jìn)而毀壞MACS柱。

4. 洗脫MACS柱時(shí)，流速越慢則分離細(xì)胞的純度越高。為了獲得高純度的陰性分離的細(xì)胞群體或除去某種細(xì)胞，可重復(fù)過柱3次，*次過柱時(shí)流速可快些（6ml/min）。如果僅為了獲得陽(yáng)性細(xì)胞，則流速可少快(3.5～5ml/min)。

5. 在MACS柱上加入液體時(shí)不要產(chǎn)生氣泡。

6. 在分離洗脫時(shí)，柱內(nèi)液體不要低于柱內(nèi)的鐵絲基質(zhì)平面以下，即始終讓鐵絲基質(zhì)內(nèi)含有液體，否則細(xì)胞分離將*失敗。

7. 如果分選的細(xì)胞還需要進(jìn)行培養(yǎng)，所有的器材和液體均應(yīng)無菌。MACS分離過程應(yīng)在超凈工作臺(tái)內(nèi)完成操作。

8. 用作細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)時(shí)，用免疫磁性微珠陰性分離細(xì)胞，因?yàn)檫@些細(xì)胞未發(fā)生抗原抗體反應(yīng)而基本上處于正常狀態(tài)；而免疫磁性微珠陽(yáng)性分離細(xì)胞，由于發(fā)生抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，可能導(dǎo)致細(xì)胞活化或凋亡，從而使細(xì)胞處于非正常狀態(tài)，影響到細(xì)胞的功能狀態(tài)。因此用免疫磁性微珠陽(yáng)性分離細(xì)胞作功能實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)十分謹(jǐn)慎。