一、原理

人外周血小淋巴細(xì)胞，通常都處在G1期（或G0期），一般情況下不進(jìn)行分裂。如在培養(yǎng)液中加入植物血凝素（PHA），這種小淋巴細(xì)胞受到刺激可轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞，進(jìn)入有絲分裂。短期培養(yǎng)后，經(jīng)秋水仙素處理，低滲和固定，即可得到大量的有絲分裂細(xì)胞。人體的1ml外周血內(nèi)一般含有約1×106~3×106個(gè)小淋巴細(xì)胞，足夠染色體標(biāo)本制備和分析之用。

二、用品和試劑

1. 5ml注射器（7號(hào)針尖），培養(yǎng)瓶、刻度吸管，需15磅滅菌20分鐘。離心管、吸管、量筒、載玻片，經(jīng)洗液按常規(guī)清洗、烘干備用。

2. 超凈工作臺(tái)，恒溫培養(yǎng)箱，天平，離心機(jī)、顯微鏡等。

3. 試劑：

（1）RPMI-1640按要求10.4克/1000ml配制成溶液，并加入NaHCO3 2.0克/1000ml以緩沖pH。*溶解后經(jīng)0.22 μm滅菌濾膜抽濾除菌。

（2）肝素鈉（肝素）：稱取0.2g溶于100ml雙蒸水中，濃度為0.2%，15磅20分鐘滅菌。

（3）秋水仙堿（秋水仙素〕，生理鹽水配制成10μg/ml濃度，15磅20分鐘滅菌，分裝，置-20℃。

（4）低滲液：0.35%KCl。

（5）固定液（Carnoy固定液） 甲醇∶冰乙酸（3∶l），臨時(shí)配制。

（6）Giemsa工作液：1份原液和10份磷酸緩沖液，臨時(shí)配制。

（7）磷酸緩沖液：1/15M Na2HPO4、1/15M KH2PO4等體積混和。

（8）5% NaHCO3滅菌濾器抽濾備用。

三、操作步驟

（一）細(xì)胞培養(yǎng)

1. 培養(yǎng)基的配制：

在超凈工作臺(tái)中，100ml培養(yǎng)基含以下成分和比例：

RPMI-1640         84ml

小牛血清           15ml

PHA                 3支

肝素鈉              1ml

卡那霉素            終濃度為100單位/ml

以5% NaHCO3（無(wú)菌）或1N HCl調(diào)pH至7.2-7.4.

用刻度吸管將培養(yǎng)液分裝入培養(yǎng)瓶（10ml/瓶），4℃?zhèn)溆谩?/em>

2. 采血：酒精消毒皮膚，肘靜脈采血0.3-0.5ml,立刻將注射針直接穿過(guò)培養(yǎng)瓶的橡膠塞，向10ml培養(yǎng)基中注入30-40滴全血，輕搖勻后置37℃恒溫箱培養(yǎng)。