1、取得*無血液殘留的肺臟：

實驗前將大鼠全身血液放凈，取得*無血液殘留的肺臟。

2、消化肺組織：

常用于細(xì)胞消化的酶有胰蛋白酶、彈性蛋白酶、膠原酶。胰蛋白酶是zui早用于消化、分離上皮細(xì)胞的酶，現(xiàn)在一般用損傷性小的彈性蛋白酶來替代胰蛋白酶。但這種酶卻有活性不穩(wěn)定，有效作用時間短暫，容易自我降解等問題。Dobbs L G等認(rèn)為彈性蛋白酶能更有選擇性的消化分離上皮細(xì)胞[9]。胰蛋白酶消化沒有選擇性，會帶來像內(nèi)皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞等一些不能在后面的分離步驟中去除的雜質(zhì)細(xì)胞，因此彈性蛋白酶更有助于提高上皮細(xì)胞的純度和產(chǎn)量。與此相反，Cunningham A C等發(fā)現(xiàn)，與彈性蛋白酶相比，用胰蛋白酶可以獲得更大產(chǎn)量的Ⅱ型上皮細(xì)胞[10]。膠原酶可以用來輔助消化細(xì)胞間質(zhì)。用幾種酶混合的方法比單一酶消化效果更好，但目前還沒有文獻定量描述*化的酶消化方法。Finkelstein J N等發(fā)現(xiàn)可以通過支氣管把酶灌注到完整的肺中消化，或把肺組織剪碎放入消化液中消化。前者比后者更有效。作者在自己的實驗中也證實了通過支氣管把酶灌注到完整的肺中消化效果更好。

3、分離純化細(xì)胞：

上皮細(xì)胞的分離純化技術(shù)經(jīng)過二三十年的發(fā)展日漸成熟，呈現(xiàn)多樣化的特點。目前對細(xì)胞的分離純化主要有以下幾種方法：

(1)密度梯度離心：

密度梯度離心分離細(xì)胞的原理是不同細(xì)胞的沉降系數(shù)不同，在密度梯度離心中細(xì)胞所處的位置也相應(yīng)不同。這是zui早用于分離Ⅱ型上皮細(xì)胞的方法，至今仍在使用。用ficoll或percoll不連續(xù)梯度離心，豬肺泡Ⅱ型細(xì)胞zui終純度可以達到70%-85%左右[11-12]。沉降系數(shù)與細(xì)胞的直徑和天然密度有關(guān)。由于Ⅱ型細(xì)胞與其他細(xì)胞存在密度和大小的交叉(如巨噬細(xì)胞)，僅僅通過離心并不能有效去除雜細(xì)胞。Kikkawa(1974)讓巨噬細(xì)胞吞噬一些重顆粒(如硫酸鋇)，改變其密度，可以幫助區(qū)分巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞。離心后的純度達到94%,但產(chǎn)量明顯減少[8]。上皮細(xì)胞的大小和密度變化范圍較大，用密度梯度離心要丟掉和其他細(xì)胞重疊的細(xì)胞層，這必然會造成某些密度大的Ⅱ型細(xì)胞損失，產(chǎn)量大大降低。

(2)濾膜分離：

濾膜分離的原理是根據(jù)細(xì)胞的大小不同來進行分離。Ⅱ型上皮細(xì)胞約10μm，比巨噬細(xì)胞(約25μm)和Ⅰ型細(xì)胞(50μm-100μm)小，用150μm孔徑的濾膜初濾除去大的組織碎片，30 μm ～40 μm孔徑的濾膜除去全部Ⅱ型細(xì)胞和部分巨噬細(xì)胞[13]，采用15μm的濾膜精濾。用濾膜分離操作簡單，它和其他分離方法聯(lián)合使用可以提高純度。

(3)流式細(xì)胞技術(shù)：

流式細(xì)胞技術(shù)分離的原理是根據(jù)不同細(xì)胞之間的熒光差異。根據(jù)不同種細(xì)胞的特征識別，用熒光物質(zhì)標(biāo)記篩選。上皮細(xì)胞內(nèi)含有豐富的脂類物質(zhì)，用親脂性熒光素標(biāo)記，可以得到純度很高的細(xì)胞。Funkhouser J D等用抗Ⅱ型上皮細(xì)胞的單抗進行免疫熒光標(biāo)記，再用流式細(xì)胞儀進行篩選，得到96%的Ⅱ型上皮細(xì)胞[14]。但熒光素對被標(biāo)記細(xì)胞有害。Rochat T R等發(fā)現(xiàn)自然熒光和直角光散射可以區(qū)分巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞，這給不經(jīng)熒光標(biāo)記分離上皮細(xì)胞提供了可能[15]。流式技術(shù)分離細(xì)胞的產(chǎn)量很低，但純度*。這種技術(shù)經(jīng)過完善在將來會更有吸引力。

(4)免疫黏附：

免疫黏附的原理是各種細(xì)胞的膜表面有不同的免疫活性物質(zhì)。巨噬細(xì)胞和其他大多數(shù)非Ⅱ型細(xì)胞表面都有IgG上的Fc片段的受體。Uhal(1989)用IgG包被塑料板，把細(xì)胞懸液置于板上，巨噬細(xì)胞和其他大多數(shù)非Ⅱ型細(xì)胞因為含有Fc片段的受體而與IgG結(jié)合，吸附到板上，不黏附的Ⅱ型細(xì)胞被沖洗下來[16]。經(jīng)過多年的摸索，這種方法近幾年已開始應(yīng)用，簡便易行，可除去絕大多數(shù)的巨噬細(xì)胞，有效的提高上皮細(xì)胞的純度。

(5)貼壁選擇：

貼壁選擇的原理是各種細(xì)胞完成貼壁的時間不同，這種特性用在培養(yǎng)時做篩選。根據(jù)zui終目的，綜合其中幾種方法能達到較好的效果。例如先用濾膜過濾，再用IgG包被法。