1、熒光原位雜交原理

FISH(fluorescence in situ hybridization)技術(shù)是一種重要的非放射性原位雜交技術(shù)。它的基本原理是:如果被檢測的染色體或DNA纖維切片上的靶DNA與所用的核酸探針是同源互補(bǔ)的，二者經(jīng)變性-退火-復(fù)性，即可形成靶DNA與核酸探針的雜交體。將核酸探針的某一種核苷酸標(biāo)記上報(bào)告分子如生物素、地高辛，可利用該報(bào)告分子與熒光素標(biāo)記的特異親和素之間的免疫化學(xué)反應(yīng)，經(jīng)熒光檢測體系在鏡下對(duì)待測DNA進(jìn)行定性、定量或相對(duì)定位分析。

2、熒光原位雜交特點(diǎn)

原位雜交的探針按標(biāo)記分子類型分為放射性標(biāo)記和非放射性標(biāo)記。用同位素標(biāo)記的放射性探針優(yōu)勢在于對(duì)制備樣品的要求不高，可以通過延長曝光時(shí)間加強(qiáng)信號(hào)強(qiáng)度，故較靈敏。缺點(diǎn)是探針不穩(wěn)定、自顯影時(shí)間長、放射線的散射使得空間分辨率不高、及同位素操作較繁瑣等。采用熒光標(biāo)記系統(tǒng)則可克服這些不足，這就是FISH技術(shù)。FISH技術(shù)作為非放射性檢測體系，有以下特點(diǎn)。

熒光原位雜交優(yōu)點(diǎn):1、熒光試劑和探針經(jīng)濟(jì)、安全;2、探針穩(wěn)定，一次標(biāo)記后可在兩年內(nèi)使用;3、實(shí)驗(yàn)周期短、能迅速得到結(jié)果、特異性好、定位準(zhǔn)確;4、FISH可定位長度在1kb的DNA序列，其靈敏度與放射性探針相當(dāng);5、多色FISH通過在同一個(gè)核中顯示不同的顏色可同時(shí)檢測多種序列;6、既可以在玻片上顯示中期染色體數(shù)量或結(jié)構(gòu)的變化，也可以在懸液中顯示間期染色體DNA的結(jié)構(gòu)。

熒光原位雜交缺點(diǎn)：不能達(dá)到100%雜交，特別是在應(yīng)用較短的cDNA探針時(shí)效率明顯下降。

3、熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)流程

FISH樣本的制備→探針的制備→探針標(biāo)記→雜交→(染色體顯帶)→熒光顯微鏡檢測→結(jié)果分析。

4、熒光原位雜交應(yīng)用

熒光原位雜交技術(shù)不但可用于已知基因或序列的染色體定位，而且也可用于未克隆基因或遺傳標(biāo)記及染色體畸變的研究。在基因定性、定量、整合、表達(dá)等方面的研究中頗具優(yōu)勢。

熒光原位雜交技術(shù)zui初用于中期染色體。從正在分化的細(xì)胞核中制備的這種染色體是高度凝縮的，每條染色體都具有可識(shí)別的形態(tài)，它們?nèi)旧髮@現(xiàn)出特征性的著絲粒位置及染色帶型。在處理中期染色體時(shí)，通過測定FISH所獲得熒光信號(hào)相對(duì)于染色體短臂末端的位置(FLpter值)來進(jìn)行作圖。使用中期染色體的不足之處在于，由于它的高度凝縮的性質(zhì)，只能進(jìn)行低分辨率作圖，兩個(gè)標(biāo)記至少分隔1Mb才能作為分開的雜交信號(hào)被分辨出來(Trask et al.，1991)。這種分辨率不足以構(gòu)建有交往的染色體圖譜。故此中期染色體FISH主要用于確定新標(biāo)記在染色體上的大概位置，為其他更精細(xì)的作圖方法做準(zhǔn)備。 一直以來，這些“其他方法”并不包括任一種FISH，但1995年后，一系列高分辨率的FISH技術(shù)已發(fā)展起來。這些技術(shù)通過改變待研究的染色體制備的性質(zhì)而達(dá)到較高的分辨率。中期染色體對(duì)于精細(xì)作圖來說凝縮度太高，因而我們需要選用較為伸展的染色體。有兩種途徑可以滿足這一要求(Heiskanen et al.，1996)： 機(jī)械伸展的染色體(mechanically stretched chromosome)通過改變從中期細(xì)胞核中分享染色體的方法而獲得。離心產(chǎn)生剪切力可將染色體伸展到正常長度20倍。每條染色體仍可識(shí)別，而FISH信號(hào)作圖方法與通常處理的中期染色體相同，這樣，分辨率可明顯提高，能夠區(qū)分出相隔200~300kb的標(biāo)記。 非中期染色體(non-metaphase chromosome)染色體僅在中期高度凝縮，而在細(xì)胞周期的其他階段保持天然未包裝狀態(tài)，有研究者曾利用前期細(xì)胞核，此時(shí)染色體凝縮程度足以區(qū)分出單個(gè)染色體。實(shí)際應(yīng)用中，這種方法并無優(yōu)于機(jī)械伸展的染色體之處。相比之下分裂間期(interphase)的染色體更為有用，因?yàn)榉至验g期(再次細(xì)胞核分裂之間)的染色體包裝程度zui低。使用分裂間期的染色體，分辨率有可能達(dá)到25kb以下，但染色體形態(tài)特征消失，推動(dòng)了定位探針位置所需的外部參照點(diǎn)。因此，該技術(shù)可在已獲得染色體粗略圖譜后使用，通常作為確定染色體一段小區(qū)域內(nèi)一系列標(biāo)記物順序的方法。 間期染色體含有去組裝的全部的細(xì)胞DNA分子。為了進(jìn)一步提高FISH的分辨率到25kb以下，有必要放棄完整的染色體，而使用純化的DNA。這種方法叫做纖維-FISH(fiber-FISH)，利用凝膠拉伸或分子梳理技術(shù)制備DNA，可以分辨間距小于10kb的標(biāo)記。