一、定義； 免疫PCR是利用抗原抗體反應(yīng)的特異性和pcr擴(kuò)增反應(yīng)的*靈敏性而建立的一種微量抗原檢測技術(shù)。 用抗體檢測抗原是免疫學(xué)的zui基本方法，用酶或同位素標(biāo)記抗體可使檢測的敏感性提高，常用的定量檢測方法ELISA和RIA均基于標(biāo)記分子可以使檢測的信號增強(qiáng)。免疫PCR是在ELISA的基礎(chǔ)上建立起來的新方法，用PCR擴(kuò)增代替ELISA的酶催化底物顯色。PCR具有很強(qiáng)的放大能力，其可以定量地檢測DNA和RNA，具有非常高的敏感性和特異性，因此，將與抗原結(jié)合的特異抗體通過連接分子與DNA結(jié)合，再經(jīng)PCR擴(kuò)增，由此定量檢測抗原使敏感性高于ELISA和RIA。
二、基本原理： 免疫PCR主要由兩個部分組成，*部分的免疫反應(yīng)類似于普通的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)的測定過程;第二部分即通常的PCR檢測，抗原分子的量zui終由PCR產(chǎn)物的多少來反映。*步中，首先用待測抗原(如牛血清白蛋白(ESA))包被微滴板孔，再加入相應(yīng)的特異抗體，于是抗體就與固相上的抗原結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，蛋白A-鏈親合素(Protein A-Streptavidin)嵌合體(重組融合蛋白)中的蛋白A部分可與固相上抗原抗體復(fù)合物中的抗體IgG結(jié)合，而鏈親合素部分可與生物素化的pUC19(質(zhì)粒DNA) (Biotin-pUC19)中的生物素反應(yīng)，從而將特定的DNA間接吸附于固相。接下來，就是第二步中的PCR過程，*步中吸附于固相的pUC19質(zhì)粒DNA在相應(yīng)的引物存在下，可經(jīng)PCR在幾小時內(nèi)而放大數(shù)百萬倍，PCR產(chǎn)物的多少與固相上抗原的量成正比。PCR由 ①待測抗原；②生物素化抗體；③親和素（連接分子）；④生物素化DNA；⑤PCR擴(kuò)增五部分構(gòu)成。
1 待檢抗原被檢測的樣品可以是抗原，或者是作為抗原的某種抗體。待檢的抗原可以直接吸附于固相，這一過程與elisa試驗(yàn)是相同的，因此有些吸附性差的抗原不能應(yīng)用目前介紹的免疫PCR方法進(jìn)行檢測，需要對免疫PCR進(jìn)行改進(jìn)，以便能夠檢測吸附性差的抗原。免疫PCR的后續(xù)過程需PCR擴(kuò)增，目前有些方法應(yīng)用的固相板或管是特殊用于免疫PCR，并且有些PCR僅可以直接用微量板進(jìn)行擴(kuò)增，這樣可以簡化實(shí)驗(yàn)過程和提高檢測的性。免疫PCR具有非常高的敏感性，特別適用于檢測微量抗原。
2 特異抗體 免疫PCR中的特異抗體是對應(yīng)于待檢抗原，與ELISA一樣，抗體的特異性和親合力將影響免疫PCR的特異性和敏感性。一般均選用單克隆抗體，這個抗體常采用生物素標(biāo)記，通過親和素再結(jié)合DNA。
3 連接分子 連接分子是連接特異抗體與DNA之間的分子。目前介紹的方法中均是通過生物素與親和素系統(tǒng)使特異抗體與DNA連接，生物素和親和素作為免疫PCR的連接分子在連接方式上有許多差異。Sano報(bào)道PCR時用的是重組葡萄球菌A蛋白-親和素嵌合蛋白(SPA-親和素)。其具有結(jié)合IgG和生物素的兩個位點(diǎn)，因此可以將IgG與生物素化的DNA連接成復(fù)合物。由于重組的SPA-親和素沒有商品試劑，且SPA不但可以結(jié)合特異抗體的IgG，而且還可以與樣品中吸附于固相的無關(guān)IgG結(jié)合，特別是檢測的抗原就是某種IgG，因此，Ruzicke認(rèn)為Sano的免疫PCR本底高和特異性差。Ruzicke用商品化的親和素系統(tǒng)試劑建立了一種免疫PCR，這種方法是先將親和素與生物素化的DNA預(yù)結(jié)合成復(fù)合物，然后再與結(jié)合固相的特異性抗體結(jié)合，這種方法存在的問題是親和素與生物素化的DNA分子預(yù)結(jié)合時二者的分子比例并不是等同的，一個親和素分子可以結(jié)合4個分子生物素，因此在預(yù)結(jié)合時生物素化的DNA分子不能過多，否則DNA分子上的生物素將親和素*飽和，親和素再無結(jié)合生物素化抗體的能力;但在低飽和生物素化DNA時，親和素結(jié)合的生物素化DNA存在許多種類的復(fù)合物，甚至還有游離的親和素，只有部分結(jié)合生物素化DNA的親和素才能起到連接分子的作用，因此，這樣預(yù)結(jié)合的親和素和生物素化DNA是一均質(zhì)性很差的混合物。雖然預(yù)結(jié)合的復(fù)合物可以減少測試過程中的1次孵育和沖洗，但是這樣的復(fù)合物作為連接分子必然導(dǎo)致敏感性低和誤差大，并且每次制備的連接分子均有差異，從而導(dǎo)致重復(fù)性差。Hong zhou等建立了一種免疫PCR方法，連接分子是鏈親和素，在連接抗體和DNA時是以游離的方式加入，這樣鏈親和素先與生物素化抗體結(jié)合，沖洗后，再加入生物素化的DNA。這個方法雖然多了1次孵育和沖洗過程，但具有較好的敏感性和重復(fù)性。