摘要： 隨著人類基因組計劃的順利進行，EST技術被廣泛應用于基因識別、繪制基因表達圖譜、尋找新基因等研究領域。利用人類基因組研究不斷產生的數(shù)據(jù)，從ESTs即cDNA的部分序列入手，通過同源篩選，獲得基因部分乃至全長cDNA序列，避免或減輕了構建與篩選cDNA文庫等繁鎖實驗室工作。本文從原理、應用及其在科學研究上產生的影響等方面對EST技術進行了概述。

表達序列標簽（expressed sequence tags,ESTs）是指從不同組織來源的cDNA序列。這一概念由Adams等于1991年提出。近年來由此形成的技術路線被廣泛應用于基因識別、繪制基因表達圖譜、尋找新基因等研究領域，并且取得了顯著成效。在通過mRNA差異顯示、代表性差異分析等方法獲得未知基因的cDNA部分序列后，研究者都迫切希望克隆到其全長cDNA序列，以便對該基因的功能進行研究。克隆全長cDNA序列的傳統(tǒng)途徑是采用噬斑原位雜交的方法篩選cdna文庫，或采用PCR的方法，這些方法由于工作量大、耗時、耗材等缺點已滿足不了人類基因組時代迅猛發(fā)展的要求。而隨著人類基因組計劃的開展，在基因結構、定位、表達和功能研究等方面都積累了大量的數(shù)據(jù)，如何充分利用這些已有的數(shù)據(jù)資源，加速人類基因克隆研究，同時避免重復工作，節(jié)省開支，已成為一個急迫而富有挑戰(zhàn)性的課題擺在我們面前，采用生物信息學方法延伸表達序列標簽（ESTs）序列，獲得基因部分乃至全長cDNAycg，將為基因克隆和表達分析提供的動力，并為生物信息學功能的充分發(fā)揮提供廣闊的空間。文本將就EST技術的應用并就其在基因全長cDNA克隆上的應用作一較為詳細的介紹。

1、ESTs與基因識別

EST技術zui常見的用途是基因識別，傳統(tǒng)的全基因組測序并不是發(fā)現(xiàn)基因zui有效率的方法，這一方法顯得即昂貴又費時。因為基因組中只有2%的序列編碼蛋白質，因此一部分科學家支持首先對基因的轉錄產物進行大規(guī)模測序，即從真正編碼蛋白質的mRNA出發(fā)，構建各種cDNA文庫，并對庫中的克隆進行大規(guī)模測序。Adams等提出的表達序列標簽的概念標志著大規(guī)模cDNA測序時代的到來。雖然ESTs序列數(shù)據(jù)對不，度zui高為97%，但實踐證明EST技術可大大加速新基因的發(fā)現(xiàn)與研究。Medzhitov等通過果蠅黑胃TOLL蛋白進行dbEST數(shù)據(jù)庫檢索，該蛋白已證實在成熟果蠅抗真菌反應中發(fā)揮重要作用，通過同源分析的方法，找到相應的人類同源EST（登錄號為H48602），這為接下來研究人類TOLL同源蛋白的功能提供了很好的條件。hMSH5基因是從釀酒酵母菌MSH5存在30%的一致性，它與hMSH4特異性相互作用，在減數(shù)分裂和精發(fā)生過程中發(fā)揮一定的作用。由此可見，應用EST技術，可以跳過生物分類學的界限，從生物模型的已識別基因迅速克隆出人和小鼠基因組相應的更復雜的未知基因。生物間在核苷酸水平上的進貨差異阻礙了傳統(tǒng)意義上的雜交或以PCR為基礎的基因克隆策略，即使是親緣關系很接近的生物也不例外，如C.elegans和C.briggsae，它們僅在2～5千萬年前分化形成。而通過計算機進行dbEST進行數(shù)據(jù)庫篩選，其配制是電子雜交實驗，提供了一條更為廣泛的基因識別路線，這一路線允許基因組間存在差異，這使得基因識別與新基因克隆策略發(fā)生革命性變化，同時它也提供了一個足夠大小和復雜的基因數(shù)據(jù)庫，目前，ESTs數(shù)量正以平均每月10萬條的速度遞增。

2、ESTs和物理圖譜構建

ESTs在多種以基因為基礎的人和植物基因組物理圖譜構建中扮演著重要角色。在這一應用中，從ESTs發(fā)展起來的PCR或雜交分析可用來識別YACs、BACs或其他含有大片段插入克隆類型的載體，它們是構建基因組物理圖譜的基礎，將EST與基因組物理圖譜相比較即可辨認出含有剩余基因序列的基因組區(qū)間，包括調控基因表達的DNA控制元件，對這些元件進行分析就有可能獲得對基因功能的詳細了解。物理圖譜與遺傳圖譜間的相互參考，形成一個用途更廣泛的綜合資源，獲得這張綜合圖譜后，研究人員就可以孟德爾遺傳特征為基礎，將相關基因定位在基因組區(qū)間上，并且通過查詢以ESTs為基礎的藶圖譜，即可獲得這一區(qū)間上所有基因的名單。該綜合資源用途的大小取決于EST數(shù)據(jù)庫中擁有的基因數(shù)目。目前人和小鼠EST的不斷擴充使其應用更加廣泛和便捷。