酵母單雜交體系(yeast one-hybrid system)常用于研究DNA-蛋白質(zhì)間的相互作用。

酵母單雜交體系可識(shí)別穩(wěn)定結(jié)合于DNA上的蛋白質(zhì)，可在酵母細(xì)胞內(nèi)研究真核DNA-蛋白質(zhì)間的相互作用，并通過篩選DNA文庫(kù)直接獲得靶序列相互作用蛋白的編碼基因。也可用于分析鑒定細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子與順式作用元件相互作用。

酵母單雜交原理：將已知的順式作用元件構(gòu)建到zui基本啟動(dòng)子(minimal promoter，Pmin)上游，把報(bào)告基因連接到Pmin下游。將待測(cè)轉(zhuǎn)錄因子的cDNA與酵母轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activation domain，AD)融合表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞，該基因產(chǎn)物如果能夠與順式作用元件結(jié)合，而激活Pmin啟動(dòng)子使報(bào)告基因表達(dá)。

酵母單雜交實(shí)驗(yàn)中cDNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒的選擇及操作步驟
酵母單雜交體系主要用于分離編碼結(jié)合于特定順式調(diào)控元件或其他DNA位點(diǎn)的功能蛋白編碼基因，驗(yàn)證反式轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，準(zhǔn)確定位參與特定蛋白質(zhì)結(jié)合的核苷酸序列。

酵母單雜交用的cDNA文庫(kù)用什么試劑盒構(gòu)建?

單雜交文庫(kù)可以用酵母雙雜交試劑盒中的SMART試劑盒來構(gòu)建

用BD公司的酵母單雜交文庫(kù)構(gòu)建和篩選試劑盒進(jìn)行酵母單雜交文庫(kù)的構(gòu)建。具體操作步驟為：在15 mL試管中依次加入如下成分：20 μL SMART cDNA、6 μL pGADT7-Rec2(0.5 μg/μL，SmaI-線性化)、5 μg pHIS2-PBE1釣餌載體、20 μL Herring Testes Carrier DNA(用前于100 ℃變性5 min，然后迅速置于冰上)、600 μL 酵母Y187感受態(tài)細(xì)胞，輕輕混勻，再加入2.5 mL PEG/LiAc (40% PEG 3350，1×TE Buffer，0.1 mol/L LiAc)，輕輕混勻。30℃溫育45 min，每隔15 min混合細(xì)胞1次，然后加入160 μL DMSO，混勻后置42℃熱沖擊20 min，每隔10 min混合細(xì)胞1次，反應(yīng)結(jié)束后700 g 離心5 min，去掉上清，用3 mL YPD Plus Liquid Medium(BD公司)重新懸浮細(xì)胞，于30℃，265 rpm振蕩培養(yǎng)90 min，700 g 離心5 min，去掉上清，用6 mL NaCl (0.9%)重新懸浮細(xì)胞。為計(jì)算轉(zhuǎn)化效率，取100 μL分別稀釋10倍、100倍、1,000倍的轉(zhuǎn)化液涂布于SD/-Leu、SD/-Trp、SD/-Leu/-Trp平板上，剩余樣品涂布于SD/-His/-Leu/-Trp(含適當(dāng)濃度的3-AT)平板篩選陽性克隆，30℃培養(yǎng)3 d-7 d。同時(shí)轉(zhuǎn)化pGADT7-Rec2-53和p53HIS2作為陽性對(duì)照以及pGADT7-Rec2-53和pHIS2作為陰性對(duì)照。