DNA分子的體外連接就是在一定條件下， 由dna連接酶催化兩個雙鏈DNA片段組鄰的5’端磷酸與3’端羥基之間形成磷酸酸脂鍵的生物化學過程， DNA分子的連接是在酶切反應(yīng)獲得同種酶互補序列基礎(chǔ)上進行的。

帶有相同末端(平端或粘端)的外源DNA必須克隆到具有匹配末端的線性質(zhì)粒載體中，但是在連接反應(yīng)時，外源DNA和質(zhì)粒都可能發(fā)生環(huán)化，也有可能形成串聯(lián)寡聚物。因此，必須仔細調(diào)整連接反應(yīng)中兩個DNA 的濃度，以便使“正確”連接產(chǎn)物的數(shù)量達水平，此外還常常使用堿性磷酸酶去除5’磷酸基團以抑制載體DNA的自身環(huán)化。利用T4 DNA連接酶進行目的DNA和載體的體外連接反應(yīng)，也就是在雙鏈DNA 5’磷酸和相鄰的3’羥基之間形成新的共價鍵。如載體的兩條鏈都帶有5’磷酸(未脫磷)，可形成4個新的磷酸二酯鍵;如載體DNA已脫磷，則只能形成2個新的磷酸二酯鍵，此時產(chǎn)生的重組DNA帶有兩個單鏈缺口，在導(dǎo)入感受態(tài)細胞后可被修復(fù)。

1、不對稱粘性末端：兩種限制酶消化后，需純化載體以提高連接效率;載體與外源DNA連接處的限制酶切位點?？杀Ａ?/span>;非重組克隆的背景較低;外源DNA可以定向插入到載體中。

2、對稱性粘性末端;線形載體DNA常需磷酸酶脫磷處理;載體與外源DNA連接處的限制酶切位點?？杀Ａ?/span>;重組質(zhì)粒會帶有外源DNA的串聯(lián)拷貝;外源DNA會以兩個方向插入到載體中。

3、平端：要求高濃度的DNA和連接酶;載體與外源DNA連接處的限制酶切位點消失;重組質(zhì)粒會帶有外源DNA的串聯(lián)拷貝;非重組克隆的背景較高 。

粘性末端連接：

實驗試劑：

用適當?shù)南拗泼赶|(zhì)粒和外源DNA。如有必要，可用凝膠電泳分離片段并(或)用堿性磷酸酶處理質(zhì)粒dna。通過酚：氯仿抽提和乙沉淀來純化DNA，然后用TE(pH7.6)溶液使其濃度為100/ml。

10×T4DNA連接酶buffer(該緩沖液應(yīng)分裝成小份，貯存于-20℃。)：200mMTris-HCl(pH7.6);50mMMgCl2;50mM二硫芐糖醇;

500μl/ml BSA(可用可不用)

T4DNA連接酶

5mM ATP

實驗步驟：

1、在無菌Eppendorf管中加入以下溶液：

1) 10μl體積反應(yīng)體系中：取載體50-100ng，加入一定比例的外源DNA 分子(一般線性載體DNA分子與外源DNA分子摩爾數(shù)為1∶1-1∶5)，補足ddH2O 至8μl。

2) 輕輕混勻，稍加離心，于45℃水浴5分鐘使重新退火的粘端解鏈， 迅速將混合物轉(zhuǎn)入冰浴。

3) 加入含ATP的10×Buffer 1μl，T4 DNA連接酶合適單位， 用ddH2O 補至10μl。

2、蓋上管蓋，充分混勻，臺式離心扣上離心5秒。

3、12℃下過夜連接反應(yīng)。

4、反應(yīng)結(jié)束后于-20℃保存。

5、再設(shè)立兩個對照反應(yīng)，其中含有(1)只有質(zhì)粒載體;(2)只有外源DNA片段。如果外源DNA量不足，每個連接反應(yīng)可用50-100ng質(zhì)粒DNA，并盡可能多加外源DNA，同時保持連接反應(yīng)體積不超過10μl。可用至少3種不同方法來測定T4噬菌體DNA連接酶的活性。

注意事項：

1、連接反應(yīng)的溫度：DNA連接酶的zui適反應(yīng)溫度為37℃，但在此溫度下， 粘性末端的氫鍵結(jié)合很不穩(wěn)定，折衷方法是12℃過夜。

2、DNA的平未端和粘性末端：由于內(nèi)切酶產(chǎn)生的DNA末端有平未端和粘性末端，因而連接反應(yīng)中就有平未端連接和粘性末端連接。 二者連接效率不同。粘性末端效率高，因而在底物濃度，酶濃度選擇上是有差異的。

3、 堿性磷酸酶處理質(zhì)粒載體：為了提高連接效率，一般采取提高DNA的濃度，增加重組子比例。這樣就會出現(xiàn)DNA自生連接問題， 為此通常選擇對質(zhì)粒載體用堿性磷酸酶處理，除去其5’末端的磷酸基，防止環(huán)化， 通過接反應(yīng)后形成的缺口可在轉(zhuǎn)化細胞后得以修復(fù)。

4、連接反應(yīng)的檢測：連接反應(yīng)成功與否，zui后的檢測要通過下一步實驗，轉(zhuǎn)化宿主菌， 陽性克隆的篩選來確定。

5、如果要檢驗連接酶和連接酶的緩沖液是否有效，可重新連接酶切后的λDNA。若連接成功，則說明有效。