一、 目的及要求。
1、 了解質(zhì)粒作為載體在基因工程中的作用
2、 熟記提取質(zhì)粒的基本原理，學(xué)習(xí)提取過程和方法
3、 為下一步實(shí)驗(yàn)提供高純度的DNA 樣品
二、原理：
1、 質(zhì)粒（Plasmid）：獨(dú)立于染色體以外的雙鏈、閉合、環(huán)狀DNA，可自我復(fù)制。為基因工程中的常用載體（Vector）
2、 作為載體的質(zhì)粒需具備以下特點(diǎn)：
1） 能自主復(fù)制。
2） 具有多個(gè)限制性內(nèi)切酶的單一酶切位點(diǎn)，又稱為多克隆位點(diǎn)（multiple cloning sites, MCS），便于外源基因的插入。
3） 具有1 個(gè)以上的篩選標(biāo)記（抗性基因）。
4） 分子量相對(duì)較小，多拷貝。
5） 非結(jié)合性質(zhì)粒。
6） 轉(zhuǎn)化效率高。
* 目前已有一系列符合上述要求的質(zhì)粒作為商品供應(yīng)。
3、 大腸桿菌中提取純化質(zhì)粒的主要步驟：
1） 細(xì)菌的培養(yǎng)：LB 培養(yǎng)基+氨芐青霉素O.D600=0.4 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 O.D600=0.6 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期
2）細(xì)菌的收集和裂解
收集：離心，STE 液洗1-2 次，去除代謝物
裂解：SDS 法、堿裂解法、煮沸法
堿裂解法：EDTA 破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞外膜→SDS 裂解細(xì)胞膜→NaOH 使核酸、蛋白質(zhì)變性。
3）質(zhì)粒的分離和純化
加入酸液，質(zhì)粒DNA、小分子RNA 復(fù)性（可溶），染色體DNA、高分子量RNA、K+/SDS/蛋白質(zhì)/膜復(fù)合
物沉淀，離心棄除；酚:氯仿抽提去除蛋白質(zhì)；RNAse去除殘留小分子RNA……。

三、試劑：
略
四、操作：
1． 將0.2ml 含重組質(zhì)粒pIL 的大腸桿菌接種于2.5ml LB 培養(yǎng)基（含Amp 100ug/ml）中，37℃、150rpm 振蕩培養(yǎng)過夜。作用：加Amp 的目的為使含Amp 抗性基因的細(xì)菌選擇性生長(zhǎng)。
2． 取1.5ml 菌液置于1.5ml EP 管中，15,000rpm 離心30 秒，棄上清，將培養(yǎng)液盡量控干。
作用：沉淀細(xì)菌。注意：控干時(shí)將吸水紙卷成圓柱狀，沿管壁輕輕吸取水珠?？馗蓵r(shí)不要觸及細(xì)菌沉淀。
3． 加入1ml STE 溶液，漩渦振蕩器上振蕩懸菌，15,000rpm 離心5min，棄上清，控干。
作用：去除培養(yǎng)基中殘留的細(xì)菌代謝物。
4． 加入100ul 溶液Ⅰ，震蕩懸菌，室溫放置5min。
作用：Glucose--增加溶液粘度，保護(hù)DNA；Tris-HCl--緩沖液；
EDTA--螯合二價(jià)陽離子，抑制核酸酶，預(yù)處理細(xì)菌。注意：在渦振蕩器上震蕩懸菌。
5． 加入200ul 溶液Ⅱ，輕輕顛倒混勻5 次，置冰浴5min。
作用：SDS--去污劑，使細(xì)胞裂解；NaOH--變性劑，使蛋白質(zhì)、核酸變性。注意：此時(shí)溶液呈膠胨狀，嚴(yán)格控制混勻次數(shù)和變性時(shí)間。
6． 加入150ul 溶液Ⅲ，顛倒混勻，置冰浴10min。
作用：酸液，中和NaOH，使質(zhì)粒DNA、小分子RNA 復(fù)性（可溶），染色體DNA、高分子量RNA、K+/SDS/蛋白質(zhì)/膜復(fù)合物不能復(fù)性而沉淀
注意：此時(shí)溶液出現(xiàn)大量絮狀沉淀
7． 15,000rpm 離心5min，將上清400ul 轉(zhuǎn)移至另一干凈EP 管中，棄沉淀。
注意：將槍頭插入溶液中央吸取，不要將沉淀吸出，用吸水紙擦拭槍頭。
8． 加入240ul 異丙醇（0.6 體積），混勻，置室溫10min。
作用：沉淀核酸（DNA、大分子rRNA、mRNA）和蛋白質(zhì)。
9． 15,000rpm 離心10min，棄上清，控干。
10． 50ul TE 溶解沉淀，加入50ul 冰預(yù)冷的5M LiCl，混勻，置冰浴10min。
作用：使大分子大分子rRNA、mRNA 沉淀，而DNA 不沉淀。
11． 15,000rpm 離心10min，上清100ul 轉(zhuǎn)移至另一EP 管中。
12． 加2 倍體積-20℃預(yù)冷的無水乙醇，混勻，-20℃沉淀10min。
13． 15,000rpm 離心10min，棄上清。
14． 待乙醇揮發(fā)后，將沉淀溶于20ul TE。將質(zhì)粒DNA 溶液置于-20℃ 保存。
五、注意事項(xiàng)：
1． 嚴(yán)格控制堿變性的時(shí)間時(shí)間，不超過5 分鐘。因?yàn)椋缳|(zhì)粒處于強(qiáng)堿性環(huán)境中時(shí)間過長(zhǎng)，可發(fā)生不可逆變性，導(dǎo)致限制性內(nèi)切酶切割困難。
2． 在加入溶液III 后，要充分混勻并置冰上。如未見大量白色沉淀，說明實(shí)驗(yàn)失敗，應(yīng)立即重做。
3． 棄上清時(shí)，必須控干即除盡管內(nèi)的液體，在做zui后一步時(shí)，應(yīng)盡量將乙醇揮發(fā)干凈，因?yàn)槿鐨埩糨^多乙醇，以后在做酶切鑒定時(shí)，乙醇會(huì)使限制性內(nèi)切酶失活。但此步的時(shí)間不宜過長(zhǎng)，一般在10-15 分鐘左右，可用濾紙條小心吸凈離心管壁上的乙醇液滴以節(jié)省時(shí)間。
六、思考題：
1． 簡(jiǎn)要說明作為基因工程的載體，質(zhì)粒必須具備哪些特點(diǎn)。
2． 簡(jiǎn)要說明質(zhì)粒提取的3 個(gè)步驟及其原理。