CR反應(yīng)條件不能產(chǎn)生所需的特異性產(chǎn)物，可采用新的寡核苷酸重新進(jìn) 行擴(kuò)增，或用凝膠電泳來分離不同的PCR產(chǎn)物，而后再各自重新擴(kuò)增進(jìn)行序列分析。 長度不同的片段可以用瓊脂糖凝膠電泳來分離:

　　1.片段大小在80-100bp時，可采用3%NuSieve1%普通瓊脂糖或用聚丙烯酰胺膠來 分離?！?/EM>

　　2.從膠上切下含所南非PCR片段的薄片。

　　3.加入50∽100μlTE浸泡膠片，可反復(fù)凍融或放置幾個小時使DNA從膠中擴(kuò)散出 來。

　　4.取少量(1-5%)進(jìn)行第二次擴(kuò)增，為得到純凈單一的產(chǎn)物，用于第二次PCR擴(kuò)增 的凝膠抽提物的量必須少于1ng。

　　5.現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)瓊脂糖含有抑制Tab聚合酶活的物質(zhì)。因而，如需重新擴(kuò)增供Tab聚合 酶測序用的片段，用丙烯酰胺電泳分離。

　　當(dāng)用PCR引物擴(kuò)增幾個同樣長度的相關(guān)序列時，如來自幾個新近復(fù)制的基因，或 重復(fù)序列或保守的信號序列(conserved signal sequences)的同樣顯子，可以通過下 列兩種不同方法來改進(jìn)電泳分離。1).先用只切割某一模板的內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，而后 電泳純化完整的PCR產(chǎn)物。2).用可使核苷酸序列不同的擴(kuò)增產(chǎn)物分開的電泳系統(tǒng)。下 一個部份將討論此類系統(tǒng)中的變性甲酰胺梯度凝膠系統(tǒng)。采用方法一時，必須事先了 解在不同PCR產(chǎn)物中的內(nèi)切酶位點。

雜合體的直接測序

　　當(dāng)兩個等位基因由于單一位點突變而產(chǎn)生差異時，用一個PCR引物直接進(jìn)行測 序，能找出雜合位點。但是，帶有幾個點突變或短片段的插入/缺失的等位模板用PC R引物之一來直接測序，將產(chǎn)生復(fù)合序列帶(compound sequencing ladders)。有四種 方法可以確定幾種點突在型并從雜合體中獲得單個等位基因的序列:1).克隆分離不同 的模板;2).在測序之前，利用模板之間核苷酸序列的差異，用電泳技術(shù)分離不同的模 板;3).在測序反應(yīng)中只啟動一個等位基因;4).只擴(kuò)增一個等位基因。

測序模板的制備

　　與PCR產(chǎn)物的直接測序有關(guān)的一些問題是變性后由于擴(kuò)增片段的兩條鏈可以迅速 結(jié)合起來，從而阻止了測序引物與它的互補(bǔ)序列退火，或阻止了引物──模板復(fù)合物 的延伸。在測序反應(yīng)中，模板鏈重新結(jié)合使一小部份模析驂與測序從而弱化zui終的測 序條帶。為減少此問題，可用改進(jìn)的標(biāo)準(zhǔn)雙鏈DNA測序法或用PCR制備單鏈模板。