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當(dāng)前位置:上海士鋒生物科技有限公司>>技術(shù)文章>>特殊組織DNA的提取及鑒定
1、提取DNA的簡(jiǎn)易方法:
1)、從全血中提取DNA:取20μl抗凝血于0.5ml無(wú)菌管中,加500μl左右的ddH2O混勻后,12000rpm離心2分鐘,棄上清,(若沉淀中仍 有紅細(xì)胞,需重復(fù)此操作1-2次)加入樣品提取液20μl,混勻,100℃煮10分鐘(可在擴(kuò)增儀上進(jìn)行)后12000rpm離心5分鐘,取上清2μl進(jìn)行擴(kuò)增。
2)、從其它有核細(xì)胞中提取DNA:可直接加適量的樣品提取液到裝有發(fā)根、頭屑、骨髓、精子、組織碎片等有核細(xì)胞的管中,100℃煮10分鐘(可在擴(kuò)增儀上進(jìn)行)后12000rpm離心5分鐘,取上清進(jìn)行擴(kuò)增。
2、從全血中用有機(jī)溶劑提取DNA:
1)試劑
a.10%SDS
b.2.0M醋酸鈉
c.20mg/ml蛋白酶k
d.苯酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)
e.分析純乙醇
f.TE(10mM Tris,1.0mMedta溶液,Ph7.5)
2)步驟
A、血液樣本收集于含EDTA的抽血用管子中,樣品用手倒轉(zhuǎn)試管混合后等分。每份700μl全血可放在1.5ml的塑料離心管中,-70℃儲(chǔ)存。
B、在解凍的(或液體的)血液中加入800μl的TE并混勻,12000rpm離心2分鐘。
C、吸取1.0ml上清液并棄去。
D、加入1.0mlTE,振蕩后離心2分鐘,去除盡可能多的上清液,但不要影響沉淀。
E、向沉淀中加入:375μl 2M醋酸鈉; 25μl 10%SDS;5μl 蛋白酶K溶液。略加振蕩,于56℃保溫一小時(shí)。
F、加入120μl苯酚/氯仿/異戊醇,振蕩30秒。
G、12000rpm離心5分鐘。
H、小心移出水相(上層)到一新的1.5ml的離心管中。
I、向水相中加入2.5倍體積預(yù)冷的分析純乙醇,倒轉(zhuǎn)試管加以混合,將試管于-20℃下放置10分鐘以上。
J、12000rpm離心10分鐘。
K、傾去酒精,用移液器小心吸去剩余酒精,不要觸動(dòng)沉淀。
L、加180μl TE 后振蕩。加20μl2M醋酸鹽,手工混勻。
M、加500μl預(yù)冷分析純酒精,用手輕輕混勻,12000rpm離心10分鐘,傾去上清液。
N、用室溫下的70%酒精1ml洗滌DNA沉淀,12000rpm離心5分鐘,傾去上清液。
O、用移液器吸去殘余的酒精,管子置于真空離心抽除殘余的酒精(大約10分鐘)?;?qū)⒐茏臃旁?00℃以下烘干。
P、加200μl TE于DNA沉淀中,混勻后于4℃保溫過(guò)夜(或56℃溶解DNA 2小時(shí)以上),次日清晨振蕩10秒。
3、從斑痕材料中用有機(jī)溶劑提取DNA
1)試劑
a.斑痕抽提緩沖液(1.21g Tris,5.84gNaCl,6.02g二硫蘇糖醇, 2%SDS,10mMEDTA/升,Ph8.0)
b.其它試劑見(jiàn)2.1)
2)步驟
A、將斑痕剪成碎片后置于1.5ml的塑料離心管中。
B、加400μl斑痕抽提緩沖液及10μl蛋白酶K溶液,混勻,離心數(shù)
秒使碎片浸入液體。
C、于56℃保溫過(guò)夜。
D、用一新的滅菌牙簽將碎片中的液體擰干后從管中取出。
E、加500μl苯酚/氯仿/異戊醇,手搖混勻,12000rpm離心3鐘。
F、將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管。
G、上清液中加入2.5倍體積預(yù)冷的分析純酒精。
H、手搖混勻試管中的各種成分,放置-20℃10分鐘以上。
I、12000rpm離心10分鐘。
J、傾去酒精。
K、用1ml室溫的70%酒精洗滌。
L、12000rpm離心5分鐘。
M、傾去酒精,用移液器吸去殘余酒精。
N、真空離心10分鐘除去殘余酒精,或在100℃以下烘干.
O、56℃下用36μl TE溶解DNA,時(shí)間至少2小時(shí)。
4、從精斑中分離提取DNA
1)試劑
a.TNE緩沖液(1.21g Tris,5.84gNaCl,0.37gEDTA/升)
b.20%sarcosyl
c.0.39M二硫蘇糖醇
d.其它試劑見(jiàn)2.1)
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