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當前位置:上海士鋒生物科技有限公司>>技術(shù)文章>>士鋒RNAi實驗原理與方法
年來的研究表明,將與mRNA對應的正義RNA和反義RNA組成的雙鏈RNA(dsRNA)導入細胞,可以使mRNA發(fā)生特異性的降解,導致其相應的基因沉默。這種轉(zhuǎn)錄后基因沉默機制(post-transcriptional gene silencing, PTGS)被稱為RNA干擾(RNAi)。
一、RNAi的分子機制
通過生化和遺傳學研究表明,RNA干擾包括起始階段和效應階段(inititation and effector steps)。在起始階段,加入的小分子RNA被切割為21-23核苷酸長的小分子干擾RNA片段(small interfering RNAs, sirnas)。證據(jù)表明;一個稱為Dicer的酶,是RNase III家族中特異識別雙鏈RNA的一員,它能以一種ATP依賴的方式逐步切割由外源導入或者由轉(zhuǎn)基因,病毒感染等各種方式引入的雙鏈RNA,切割將RNA降解為19-21bp的雙鏈RNAs(siRNAs),每個片段的3’端都有2個堿基突出。
在RNAi效應階段,siRNA雙鏈結(jié)合一個核酶復合物從而形成所謂RNA誘導沉默復合物(RNA-induced silencing complex, RISC)。激活RISC需要一個ATP依賴的將小分子RNA解雙鏈的過程。激活的RISC通過堿基配對定位到同源mrna轉(zhuǎn)錄本上,并在距離siRNA3’端12個堿基的位置切割mRNA。盡管切割的確切機制尚不明了,但每個RISC都包含一個siRNA和一個不同于Dicer的RNA酶。
另外,還有研究證明含有啟動子區(qū)的dsRNA在植物體內(nèi)同樣被切割成21-23nt長的片段,這種dsRNA可使內(nèi)源相應的DNA序列甲基化,從而使啟動子失去功能,使其下游基因沉默.
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