生命活動(dòng)與蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化密切相關(guān), 很多情況下某些蛋白質(zhì)是通過各種翻譯后修飾來完成或改變其功能。在數(shù)量眾多的蛋白質(zhì)翻譯后修飾中，蛋白質(zhì)磷酸化修飾無疑是zui重要的一類，它是指通過蛋白激酶（Protein kinase，PK）介導(dǎo)的酶促反應(yīng)把磷酸基團(tuán)從一個(gè)化合物轉(zhuǎn)移到另一個(gè)化合物上的過程^[1]（Figure 1所示），是生物體內(nèi)存在的一種普遍的調(diào)節(jié)方式。現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)的所有人類蛋白質(zhì)中超過30%可被磷酸化修飾，這一修飾在細(xì)胞信號(hào)的傳遞過程中占有極其重要的地位，與生命活動(dòng)的許多過程都密切相關(guān)，對(duì)此的研究已經(jīng)成為蛋白質(zhì)科學(xué)的熱點(diǎn)之一。
 

磷酸化多肽（主要指肽鏈中的酪氨酸、絲氨酸和蘇氨酸殘基的側(cè)鏈羥基被磷酸化生成酸式磷酸酯的修飾多肽）是研究蛋白質(zhì)磷酸化過程的*的工具，它可作為磷酸酶模型底物，或作為可產(chǎn)生抗磷酸化蛋白抗體的抗原，也可以在確定磷酸化蛋白的物理參數(shù)時(shí)作為參考化合物等^[3]。因此磷酸化多肽的合成在過去的幾年中吸引了相當(dāng)大的興趣，目前已確定了較為成熟的合成路線，使磷酸化多肽的合成趨于常規(guī)。目前磷酸化多肽的合成主要有兩個(gè)策略：后磷酸化法（Global phosphorylation）和單體法（Building block approach），如Figure 2所示。前者是在多肽序列合成結(jié)束后再在固相載體上對(duì)絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸的側(cè)鏈羥基進(jìn)行磷酸化，可以在同一次合成中同時(shí)得到帶有和不帶有磷酸化位點(diǎn)的多肽；而后者則將適當(dāng)保護(hù)的磷酸化氨基酸直接引入到多肽序列中，操作較前者更為簡(jiǎn)單，現(xiàn)已成為磷酸化多肽合成的策略。

在采用單體法構(gòu)建磷酸化多肽時(shí)，目前廣泛采用的原料為側(cè)鏈單芐基保護(hù)的氨基酸：Fmoc-AA(PO(OBzl)OH)-OH (AA = Ser, Thr or Tyr)。這類保護(hù)的磷酸化位點(diǎn)由于側(cè)鏈磷酸化基團(tuán)的離子化而產(chǎn)生較大的位阻效應(yīng)，并且磷酸化位點(diǎn)的引入往往能促進(jìn)肽鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成^[4]，故而磷酸化位點(diǎn)及其后的氨基酸的引入會(huì)比較困難。這些問題在合成含有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)的多肽時(shí)將會(huì)變得尤為嚴(yán)重，往往會(huì)使zui終產(chǎn)物的組成非常復(fù)雜，難以進(jìn)行純化，甚至直接導(dǎo)致合成的失敗。

一般來講，增加投料量和延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間都能促使連接反應(yīng)趨于*，但增加投料量無疑會(huì)提高合成成本，對(duì)于較昂貴的帶有保護(hù)的磷酸化氨基酸更是這樣，而延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間則可能增加其它副反應(yīng)發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，故而在合成磷酸化多肽時(shí)，需要對(duì)氨基酸投料量、反應(yīng)方法以及反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)等進(jìn)行優(yōu)化調(diào)整以期達(dá)到更理想、更經(jīng)濟(jì)的合成效果。我們有針對(duì)性地對(duì)磷酸化多肽合成條件進(jìn)行了探索和調(diào)整，采用zui終的優(yōu)化條件成功合成了含有多達(dá)六個(gè)磷酸化絲氨酸殘基的多肽：FAM-Ahx-X(pS)XX(pS)X(pS)X(pS)XX(pS)X(pS)-NH2（客戶肽，詳細(xì)序列未給出；其氨基端標(biāo)記FAM以進(jìn)行熒光檢測(cè)），經(jīng)過RP-HPLC純化后zui終純品的純度高達(dá)95%（見Figure 3）。