1. 280nm的光吸收法

因蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm處具有zui大吸收，且各種蛋白質(zhì)的這三種氨基酸的含量差別不大，因此測(cè)定蛋白質(zhì)溶液在280nm處的吸光度值是zui常用的紫外吸收法。

測(cè)定時(shí)，將待測(cè)蛋白質(zhì)溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白質(zhì)溶液的溶劑（水或緩沖液）作空白對(duì)照，在紫外分光度計(jì)上直接讀取280nm的吸光度值a280。蛋白質(zhì)濃度可控制在0.1～1.0mg/ml左右。通常用1cm光徑的標(biāo)準(zhǔn)石英比色皿，盛有濃度為1mg/ml的蛋白質(zhì)溶液時(shí)，a280約為1.0左右。由此可立即計(jì)算出蛋白質(zhì)的大致濃度。

許多蛋白質(zhì)在一定濃度和一定波長(zhǎng)下的光吸收值（A1％1cm）有文獻(xiàn)數(shù)據(jù)可查，根據(jù)此光吸收值可以較準(zhǔn)確地計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。下式列出了蛋白質(zhì)濃度與（A1％1cm）值（即蛋白質(zhì)溶液濃度為1%，光徑為1cm時(shí)的光吸收值）的關(guān)系。文獻(xiàn)值A(chǔ)1％1cm，稱為百分吸收系數(shù)或比吸收系數(shù)。

蛋白質(zhì)濃度 = (A280′10 )/ A1％1cm,280nm (mg/ml)

(q 1%濃度  10mg/ml)

例：牛血清清蛋白 ： A1％1cm=6.3 (280nm)

溶菌酶 ：   A1％1cm=22.8 (280nm)

若查不到待測(cè)蛋白質(zhì)的A1％1cm值，則可選用一種與待測(cè)蛋白質(zhì)的酪氨酸和色氨酸含量相近的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液配制的濃度為1.0mg/ml。常用的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)為牛血清清蛋白（BSA）。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定：取6支試管，按下表編號(hào)并加入試劑：

用第1管為空白對(duì)照，各管溶液混勻后在紫外分光光度計(jì)上測(cè)定吸光度A280，以A280為縱座標(biāo)，各管的蛋白質(zhì)濃度或蛋白質(zhì)量（mg）為橫座標(biāo)作圖，標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)為直線，利用此標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測(cè)出的未知樣品的A280值，即可查出未知樣品的蛋白質(zhì)含量，也可以用2至6管A280值與相應(yīng)的試管中的蛋白質(zhì)濃度計(jì)算出該蛋白質(zhì)的A1％1cm，280nm

2. 280nm和260nm的吸收差法

核酸對(duì)紫外光有很強(qiáng)的吸收，在280nm處的吸收比蛋白質(zhì)強(qiáng)10倍（每克），但核酸在260nm處的吸收更強(qiáng)，其吸收高峰在260nm附近。核酸260nm處的消光系數(shù)是280nm處的2倍，而蛋白質(zhì)則相反，280nm紫外吸收值大于260nm的吸收值。通常：

純蛋白質(zhì)的光吸收比值：A280/A260  = 1.8

純核酸的光吸收比值： A280/A260 = 0.5

含有核酸的蛋白質(zhì)溶液，可分別測(cè)定其A280和A260，由此吸收差值，用下面的經(jīng)驗(yàn)公式，即可算出蛋白質(zhì)的濃度。

蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)=1.45×A280－0.74×A260

此經(jīng)驗(yàn)公式是通過一系列已知不同濃度比例的蛋白質(zhì)（酵母烯醇化酶）和核酸（酵母核酸）的混合液所測(cè)定的數(shù)據(jù)來建立的。

3. 215nm與225nm的吸收差法

蛋白質(zhì)的稀溶液由于含量低而不能使用280nm的光吸收測(cè)定時(shí)，可用215nm與225nm吸收值之差，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法來測(cè)定蛋白質(zhì)稀溶液的濃度。

用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，配制成20～100 mg/ml的一系列5.0ml的蛋白質(zhì)溶液，分別測(cè)定215nm和225nm的吸光度值，并計(jì)算出吸收差：

吸收差d= A215 －A225

以吸收差d為縱座標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度為橫座標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。再測(cè)出未知樣品的吸收差，即可由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度。