多克隆抗體的制備步驟

一、器材

剪刀（剪兔毛用）一把、彎頭*子（游離血管用）一把、直頭眼科*（剪血管用）一把，*架，*片，注射器（1ml、10ml，25ml）附針頭，兔子固定架，滅菌三角燒瓶（200ml）或平皿（直徑18cm）、彎頭*四把，直頭*兩把，手術(shù)縫合線，塑料放血管，紗布等。

二、試劑

生理鹽水

弗氏*佐劑（Freund’s complete adjuvant， FCA）

弗氏不*佐劑（Freund’s incomplete adjuvant， FIA）

二甲苯，酒精棉，脫脂棉，2% NaN3

三、免疫原：蛋白或KLH偶聯(lián)的多肽。每次免疫100-200μg免疫原。

四、兔子的選擇

兔子的重量應(yīng)在四斤以上，兩耳光滑，明顯可見耳靜、動(dòng)脈，健康。

五、免疫

用生理鹽水稀釋免疫原，然后與相應(yīng)的佐劑進(jìn)行1:1混合。抗原和佐劑*混合形成穩(wěn)定的乳劑，將該乳劑在兔子雙肩周圍的皮膚下進(jìn)行皮下注射和后大腿進(jìn)行肌肉注射。每個(gè)區(qū)域大約用1/4的免疫原。這樣免疫原可以持久存在從而提高免疫應(yīng)答。

注：

抗原注射以前需要收集一些正常血清，已備檢測(cè)抗體時(shí)作為陰性對(duì)照。待兔子在新環(huán)境中穩(wěn)定，大概需要四天左右時(shí)間，可以進(jìn)行耳動(dòng)脈取血。取血量約5ml足矣。

免疫用的抗原必須純化，否則影響抗體的質(zhì)量?？乖?jīng)FCA或FIA充分乳化后才能注射。將抗原液與佐劑等比例混合后，置于混合器上使之劇烈振蕩使抗原充分乳化，乳化過(guò)程比較費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，但若乳化不充分，會(huì)影響免疫的效果，振蕩后，1000rpm離心一分鐘，如水相和油相不分層即可注射。免疫用FCA，以后都用FIA。

免疫方法可采用背部多點(diǎn)注射法。即于家兔脊柱兩旁選4-6點(diǎn)皮下注射，每點(diǎn)注0.1ml，間隔2周后再于上述部位選不同點(diǎn)注射（不要選擇臨近位點(diǎn)，否則潰瘍愈合不好）。每次免疫的抗原量約100μg。免疫次數(shù)在四五次即可，抗原用量大可以減少次數(shù)。

六、取血：

免疫一周后，可以耳動(dòng)脈取血檢測(cè)抗體效價(jià)。因?yàn)槠鸪鯉状蚊庖弋a(chǎn)生的抗體的效價(jià)比較低，頭兩次取血，夠檢測(cè)用即可。在三次免疫后，可以獲得較價(jià)的抗體，每次取血量可以在40ml，不要取太多，否則會(huì)造成兔子貧血。

前幾次取血用19號(hào)針頭對(duì)兔子進(jìn)行耳動(dòng)脈取血，室溫**析出血清。

zui后一次取血可以采用頸動(dòng)脈放血，具體操作如下：

1、家兔仰臥于兔架上固定頭部，用紗布固定四肢。頭部略放低以暴露頸部。剃毛并消毒皮膚。

2、沿頸部中線用*切開皮膚約10cm，分離皮下結(jié)締組織，直至暴露出氣管兩側(cè)的胸鎖乳突?。ㄐ⌒牟僮鳎缗龅叫⊙艹鲅?，可用*止血）。

3、用直頭*分離胸鎖乳突肌與氣管間的頸三角區(qū)疏松組織，暴露出頸總動(dòng)脈后用彎頭*使之游離，剝離神經(jīng)和結(jié)締組織。

4、于動(dòng)脈下套入兩根黑絲線，分別置于遠(yuǎn)心及近心端。結(jié)扎遠(yuǎn)心端的絲線。近心端的動(dòng)脈用*夾住。

5、用小拇指墊在血管下，用尖頭眼科*在兩根絲線間的動(dòng)脈璧上剪一小口（勿剪斷），插入塑料放血管。再將近心端的絲線結(jié)扎固定于放血管上，以防放血管滑脫。

6、松開*，使血液流入容器中。一般一只家兔可放血100-120ml。

七、血清的分離

如果用三角瓶或平皿盛血，將器皿傾斜放置于37oC烘箱2hr，轉(zhuǎn)移到4oC沉淀**，第二天早上用吸管吸取血清。如果用離心管收集，37oC烘箱放置2hr，轉(zhuǎn)移到4oC沉淀**，第二天早上離心，10000RCF，10分鐘。在血清中加入NaN3 至終濃度0.02%，分裝后-20oC保存。

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